TRIM21蛋白结构及其应答病原感染的研究进展

石钧戈，周作勇,2*，王芝英,2*

(1.西南大学动物科学学院，重庆荣昌402460；2.重庆市兽医科学工程研究中心，重庆荣昌402460)

TRIM (Tripartite motif)蛋白家族是一系列细胞内具有广泛生物学活性的蛋白，约有80 多种。其中TRIM21 蛋白在各种类型细胞，特别是某些免疫细胞如T 细胞、巨噬细胞和树突状细胞中广泛表达[1]。TRIM21 最先作为自身抗原被发现，又称为Ro52/SS-A，常引起干燥综合征、系统性红斑狼疮和系统性硬化症等自身免疫病[2]。随着对TRIM21 蛋白结构和功能的深入研究发现TRIM21 蛋白具有E3 泛素连接酶活性，并在固有免疫和适应性免疫的调控中发挥重要作用。TRIM21 蛋白是目前在哺乳动物体内发现的唯一一个细胞浆内IgG 受体[3]，其介导的抗体依赖的细胞内中和反应(Antibody-dependent intracellular neutralization，ADIN)拓宽了人们对中和反应的认识。此外，TRIM21 蛋白还在固有免疫中调控多种细胞因子的分泌。本文主要介绍TRIM21 的分子结构和其介导的ADIN 以及调节固有免疫的作用。

1 TRIM21蛋白的结构

人源TRIM21 蛋白的分子量为52 ku，共含有475 个氨基酸，内含多个功能结构域(图1A)。其氨基端包含的RBCC 结构域(RING-finger、B-box 和 Coiled-coil 结构域)是TRIM 蛋白家族具有的保守特征之一[4]。RING-finger 结构域具有泛素化活性，是TRIM21 作为E3 泛素连接酶参与细胞代谢途径的基础，该结构域中保守的半胱氨酸和组氨酸残基形成两个锌离子结合位点。B-box 结构域也可以和锌离子结合，锌离子可能对维持该蛋白三维结构的稳定有重要作用[5]。B-box 是TRIM 蛋白家族特有的一种高度保守的功能结构域，约由40 个氨基酸残基组成，分为B-box1 和B-box2 两种类型。该结构域能够在氨基酸短序列中形成复杂且多样化的结构，可能是研究生物进化的良好素材。TRIM21 的B-box 结构域由3 条β 折叠股和一个α 螺旋片段按 ββαβ 顺序形成类似 RING-finger 结构域的折叠[6]，该结构与E2 泛素结合酶竞争RING-finger 中的结合位点，从而调控TRIM21 蛋白的泛素化活性[7]。此外，有研究表明 TRIM21 的 B-box 与 RING-finger 结构域结合的同时还可以和coiled-coil 结构域结合[6]，但它们之间的相互作用关系及功能尚不完全清楚。Coiled-coil 结构域是具有多个α 螺旋相互缠绕形成的超二级结构，其能够促进TRIM21 分子的同源二聚化，定位其它结构域形成高度有序且稳定的大分子聚合体，参与对底物的识别和泛素化过程[8]。

TRIM21 蛋白的羧基端是由PRY 和SPRY 两个子结构域构成的一个具有结合和识别功能的PRYSPRY 结构域，分别长约60 和150 个氨基酸残基[9]。James 等研究表明PRYSPRY 是一个近似球形的三维立体折叠结构，内含一个由两个反向平行的β 折叠构成的扭曲β- 三明治结构；同时，研究阐明了TRIM21 分子通过PRYSPRY 与IgG 分子Fc 片段结合的结构基础和分子生物学过程[10]。PRYSPRY 和免疫球蛋白一样是具有氨基酸组成和排列顺序高度可变的序列，PRYSPRY 在PRY 和SPRY 子结构域中形成两个与抗体Fc 片段结合的位点，PRY 位点仅和免疫球蛋白分子的CH2 区域结合，而 SPRY 位点则结合CH3 区域(图1B)，并且单个 TRIM21 分子的 PRYSPRY 结构域仅与免疫球蛋白分子的一条重链结合[10]。二聚体TRIM21 蛋白则可以同时结合IgG 分子的两条重链，该结合方式使得TRIM21 蛋白对抗体的识别更加准确迅速[11]。

图1 TRIM21 蛋白的结构

2 TRIM21蛋白的功能

2.1 TRIM21 介导抗体依赖的细胞内中和反应(ADIN)抵抗病毒感染 病毒中和反应被认为是机体内阻止病毒吸附和侵入细胞的重要机制，该机制通过抗体与病毒表面的粘附作用或与细胞毒性抗原决定簇结合使病毒丧失活性，从而保护机体免受病毒侵害。长期以来，中和反应被局限地理解为抗体与病毒单纯在细胞外发生结合，且不需要其它效应分子的参与[9,12]，直到发现TRIM21 蛋白与IgG 的相互作用[13]才有了新的认识。已有研究显示并非所有的抗体与病毒结合均具有中和效应，病毒粒子被非中和抗体结合后可能仍然具有侵染细胞的能力[3]。这些携带有非中和抗体的病毒进入细胞后被胞浆内的TRIM21 蛋白识别引起TRIM21 蛋白自身泛素化，激活蛋白酶体清除病毒并促进一系列免疫信号分子的表达，这一过程被称为抗体依赖的细胞内中和反应(Antibody-dependent intracellular neutralisation，ADIN)[12]。随着对TRIM21 蛋白结构与功能探索的深入，ADIN 的机制也越来越清楚。

当被抗体“标记”的病毒进入细胞浆后，二聚体TRIM21 分子便通过其PRYSPRY 结构域结合到病毒上抗体Fc 片段，该过程激活了TRIM21 分子的E3 泛素连接酶活性。活化后的TRIM21 蛋白在E2 泛素结合酶等的作用下自身多聚泛素化，形成含有K63 泛素链(K63-linked ubiquitin chains)和 K48 泛素链的 TRIM21 分子[3,14]。而病毒粒子或抗体是否也会被泛素化还有待进一步研究[3]。随着泛素化过程的进行，大量的蛋白酶体聚集并溶解TRIM21-抗体-病毒复合物。溶解过程不仅与K48 泛素链的活性有关，还需要含缬酪肽蛋白(Valosin containing protein，VCP)的参与[15]，VCP 可以促进蛋白酶体对底物的识别和降解[16]。TRIM21-抗体-病毒复合物溶解后释放出游离的K63 泛素链，激活 NF-κB、AP-1、IRF3、IRF5 和 IRF7 等免疫相关信号通路，释放 IL-6、CCL4、TNFα 和 IFNβ 等促炎细胞因子[3]，辅助机体免疫系统抵抗病原感染。同时，病毒粒子衣壳蛋白降解后释放的核酸被 RIG-I(识别 RNA)和cGAS(识别DNA)识别，激活各种免疫相关信号通路，从而清除被释放到细胞内的病毒核酸[17](图2)。

图2 抗体依赖的细胞内中和反应通路图(参考 Foss[11]等和 Watkinson[17]等绘制)

目前报道的能够激活ADIN 而被清除的病毒均为无囊膜病毒，包括口蹄疫病毒(FMDV)、人腺病毒 5 型(hAdV5)[18-19]等。这可能是由于有囊膜病毒在侵入细胞时不将病毒表面的抗体带入细胞浆，无法被胞内的TRIM21蛋白所识别[18]。这在一定程度上也表明了TRIM21 蛋白的激活需要借助于抗体[3]。此外，TRIM21 蛋白还可以通过类似机制抵抗肠道沙门氏菌(salmonella enterica)感染[20]，提示ADIN 反应对某些胞内菌的清除也有重要意义。TRIM21 蛋白与其它的Fc 受体不同，它广泛地结合各种不同类型的抗体分子，如IgA、IgG 和IgM[21]。理论上，凡是和抗体分子结合的病原微生物进入胞浆被TRIM21 分子识别后均能够引起ADIN，但乳头瘤病毒衣壳蛋白L2的单克隆抗体不能激活ADIN，这表明TRIM21 对抗体的识别可能还存在更加复杂的机制。

在经典中和反应过程中，必须有足量的抗体与病毒上所有具有侵染或细胞毒性功能的表位结合才能发挥作用。而ADIN 仅需少量的抗体即可抵抗病毒侵入[22]。免疫系统被病原刺激后产生足量抗体需要一定时间，尤其在初次免疫的早期抗体含量往往较低，由此推测TRIM21 介导的ADIN 可能在针对胞内病原产生初次免疫应答的早期发挥至关重要的作用。

2.2 TRIM21 参与固有免疫应答 固有免疫是机体在长期进化中逐渐形成的抵御病原侵入的非特异性防御功能，其是免疫应答的基础，对适应性免疫也有着重要的调控作用。TRIM21 蛋白不仅作为抗体的Fc 受体在细胞内协调体液免疫，同时也是固有免疫中重要的信号分子。当侵入机体的病原体相关分子模式(PAMPs)被相应的模式识别受体(PRRs)识别，TRIM21 蛋白作为多种模式识别受体的下游信号分子参与固有免疫应答过程[23]。目前关于TRIM21在固有免疫中的研究主要集中在其与干扰素调节因子(interferon regulatory factor，IRF)互作和炎症调控方面。

Higgs 等发现TRIM21 参与IRF3 多聚泛素化并诱导蛋白酶体将其降解，从而抑制IFN-β 的产生[24]。这一结论在Manocha 等用流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)侵染人类小胶质细胞(CHME3)的实验[25]中得到证实。但有研究显示在水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)和鸡新城疫病毒 (Newcastle disease virus，NDV)感染过程中TRIM21 阻碍IRF3 的泛素化和降解，促进干扰素的表达，增强机体抗病毒能力[25]。以上相互矛盾的实验结果可能与不同类型病毒感染、感染持续时间以及上游信号传导途径等实验条件差异有关[25]。在对IRF8 与TRIM21 蛋白互作的研究中也发现类似的情况[26-27]。Kim等认为在细胞被刺激的早期，TRIM21 蛋白能够促进IRF8的转录活性，随着选择性自噬接头蛋白p62 (Sequestosome 1/p62，p62)表达量增加，在p62 调控下TRIM21 转而促进大量IRF8 泛素化，使其被蛋白酶体降解[27]。P62 的参与使得TRIM21 在感染的不同时期发挥不同的作用，TRIM21 调控IRF3 的过程中是否也有同样的作用机制尚不清楚。此外，现已证实IRF7 和IRF5 可以被TRIM21 泛素化，进而被蛋白酶体降解[28-29]。TRIM21 与IRF 互作是一个极其复杂的过程，在TRIM21 泛素化IRF 的同时，IRF 也可以反馈调节细胞内 TRIM21 蛋白的表达[30]。TRIM21 蛋白通过与IRF 的互作，调节干扰素的生成，参与固有免疫系统维持机体内环境稳定。

除了与IRF 互作外，TRIM21 还与多种促炎细胞因子分泌有关。TRIM21 不仅能够间接引起ADIN 反应中炎症相关通路激活，还能直接负调控NF-κB 依赖的炎症通路，减少 IL-1、 IL-6、 TNFα和CXCL10的分泌[1]。此外，TRIM21 还可通过泛素化线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)促进白介素和促炎细胞因子的分泌。Lenart 等发现TRIM21 在CD16+单核细胞和巨噬细胞中具有促炎症反应的“开关”功能，使炎症反应在应答病原的过程中有序进行[31]。TRIM21 还能通过调控炎症细胞因子的分泌抵抗胞内寄生弓形虫(Toxoplasma gondii)感染[32]。综上，TRIM21作为连接固有免疫和适应性免疫的关键信号分子，对机体应答病原感染有重要作用。

3 展 望

TRIM21 作为连接固有免疫和适应性免疫的桥梁，建立起一道应答病原侵入的新防线。目前，有关TRIM21 应答病原感染机制的研究主要集中在病毒，而对其它胞内寄生的病原微生物的研究还很少。此外，TRIM21 作为E3泛素连接酶能否直接引起病原体蛋白的泛素化还不得而知。对TRIM21 应答病原机制的研究不仅有助于更好地认识自身免疫系统，同时也为某些疾病提供了可能的临床诊疗方法。首先，基于ADIN 杀灭胞内病原的机理，可以通过某些技术使抗体进入胞内并激活ADIN 清除胞内病原，从而制备更加高效的中和抗体。目前，已有研究将乙型肝炎病毒(HBV)的单克隆抗体与细胞穿透肽结合，使该抗体能够穿过细胞膜与胞内病毒结合，激活TRIM21 介导的ADIN 反应而清除病毒，在体内外均取得了较好的抗感染效果[33]。其次，TRIM21 蛋白作为固有免疫中重要的信号分子，其必然与某些感染性疾病之间存在一定的联系，能否将TRIM21 作为生物标志分子指示某些疾病的发生？目前在结核病和病毒性呼吸道感染中已有相关的研究，但均未取得令人满意的结果[33]。该方向的探索可能对其它某些疾病的诊断具有重要的意义。此外，有研究发现TRIM21参与SALL4(Sal-like protein 4)的降解从而抑制肿瘤细胞的增殖和转移[34]，其能否为肿瘤治疗提供新方法还有待进一步探究。