鸡传染性法氏囊病病毒DK株VP2基因序列分析及其对SPF雏鸡的致病力

雷赟赟，林绍青，刘秉珲，于高博，武 琦，周五朵,2，黄宝钦，吴异健,2*

(1.福建农林大学动物科学学院，福建福州350002；2.福建省兽医中药与动物保健重点实验室，福建福州350002；3.福建圣农发展股份有限公司，福建南平354100)

传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)是鸡传染性法氏囊病(IBD)的病原体，临床上引起幼龄鸡(3 周龄～8 周龄)急性、高度接触性的传染性疾病，侵害鸡的中枢免疫器官法氏囊[1]。法氏囊是禽体内能够产生抗体的B 淋巴细胞分化、成熟的场所，分化完全的B 淋巴细胞继而从法氏囊中迁移到外周免疫器官，并发挥重要的免疫功能[2]。IBDV 主要在鸡的B 淋巴细胞中复制，且偏嗜于活跃的增殖细胞，对不成熟或前体B 淋巴细胞比成熟的B 淋巴细胞的影响更大[3]。IBDV 有2 个血清型，血清I 型病毒对鸡有致病力，对火鸡无致病力；血清II 型病毒从火鸡中分离，为非致病型。血清I 型病毒根据毒力差异分为经典株、超强株、变异株和致弱株4 大类[4]。由于疫苗的不断使用，在免疫选择压力的作用下，病毒出现了许多IBDV 超强株和变异株，导致病毒致病力及宿主对疫苗免疫应答的改变，使之越来越难以防控，造成重大经济损失[4-5]。

IBDV DK 株是从福建某鸡场分离鉴定的IBDV野毒株，本实验对其毒力和致病性进行了研究，为该株病毒分离地区IBD 的防控提供了临床流行病学和分子流行病学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 IBDV DK 株由本实验室从福建某鸡场发病的鸡群中分离鉴定并保存；SPF 种蛋购自济南斯帕法斯家禽有限公司，本实验室自行孵化。

pMD18-T、DL2000 DNA Marker 购自宝生物工程(大连)有限公司；DH5α 感受态细胞、Trans ZolTMUp RNA 提取试剂盒购自北京全式金公司；RT-qPCR 试剂盒和T4 连接酶均购自Promega 公司；胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒均购自Omega 公司；普通PCR Mix 购自北京康为世纪公司；2×Phanta Max Buffer、dNTP Mix (10 mM each)、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 均购自南京诺唯赞公司。

1.2 动物感染试验 将IBDV DK 株病毒液10 倍倍比稀释至10-8，按常规方法进行鸡胚半数致死量(ELD50)检测。对 20 日龄实验雏鸡以 2×103ELD50/0.2 mL/ 羽，分别经滴鼻、点眼、口服接种感染，每组12 只。同时分别设滴鼻、点眼、口服0.2 mL PBS/ 羽为健康对照组鸡，每组12 只观察并记录SPF 鸡死亡情况。对死亡鸡剖检，观察记录其剖检变化。取病变法氏囊和脾脏，按常规方法制作病理切片、HE 染色后观察组织病理学变化。

1.3 VP2 基因的扩增与序列分析 根据GenBank登录的IBD10SD02(KM523631)VP2 基因序列，利用Primer 5.0 软件设计出一对扩增IBDV VP2 基因的全长特异性引物。上游引物为F：5'-ATGACAAACCT GCAAGAT-3'，下游引物为R：5'-CAGCTATCCTCC TTATGG-3'，预期扩增的目的基因片段为1 365 bp，引物由上海铂尚生物公司合成。提取IBDV DK 株总RNA 并反转成cDNA，以其为模板PCR 扩增IBDV VP2 基因、PCR 产物回收纯化后与pMD18-T 载体连接、筛选阳性克隆株由上海铂尚生物公司测序。对测序结果进行比较、分析，并绘制VP2 基因推导的氨基酸序列的遗传进化树。

2 结果与讨论

2.1 IBDV DK 株的致病性试验结果 根据接种病毒的鸡胚死亡情况，利用Reed-Muench 法计算出IBDV的 ELD50为 10-4.50/0.2 mL。实验鸡感染 IBDV DK 株后出现畏寒、扎堆、精神沉郁、采食量减少、饮水增多、排出白色稀粪等临床症状，感染后3 d～5 d出现死亡。剖检病死鸡可见大腿肌肉和胸部肌肉均出现出血和脱水症状，肾脏肿大或有出血、肌胃与腺胃交界处有出血。法氏囊肿大，表面有黄色渗出液、有的法氏囊肿大出血呈“紫葡萄”样。法氏囊剪开后，内部皱褶肿大、出血、肠道黏膜内容物增加、发病率为100 % (12/12、12/12、12/12)、平均死亡率为44.4 % (4/12、6/12、6/12)。对照组鸡正常。表明IBDV DK 分离株具有较强的致病力。法氏囊和脾组织按常规方法制作病理切片、经HE 染色后观察可见，法氏囊淋巴滤泡结构模糊、大量的淋巴细胞出现水肿、坏死、崩解；滤泡间水肿、髓质区形成囊状空腔、存在吞噬细胞，其中大多数为异嗜细胞、滤泡变性。髓质部变成一个由许多细胞残屑构成的团块，周围环绕着残存的皮质、网状组织间散在有少量即将变性的细胞。脾脏红髓区内淋巴滤泡结构消失，大量淋巴细胞变性坏死。对照组SPF鸡无明显病理变化(图1)。表明实验鸡感染IBDV DK 株后以法氏囊滤泡淋巴细胞坏死为其主要特征，间质及滤泡外围的伪嗜酸性粒细胞浸润；脾脏主要表现为广泛的淋巴细胞坏死为特征的急性炎症，引起感染鸡法氏囊等免疫器官损伤、导致免疫抑制。

图1 IBDV DK 株感染鸡的组织病理学变化(HE，100×)Fig.1 Histopathological changes of the organ tissues in artificially infected chickens (HE,100×)

2.2 病毒VP2 基因的扩增与序列分析结果2.2.1 DK 分离株VP2 基因的扩增 以提取的病毒基因组反转录获得的cDNA 为模板PCR 扩增其VP2基因。结果显示，得到了约1 400 bp 的特异性条带，与预期大小一致(图2)。重组质粒pMD18-TVP2 经测序显示目的基因序列为1 365 bp，且与IBD10SD02 的同源性为94.6 %。进一步表明扩增的目的片段正确。

图2 VP2 基因的PCR 扩增结果Fig.2 Amplification of VP2 gene by PCR

2.2.2 分离株VP2 基因序列分析 根据VP2 基因测序结果与参考株的相应基因序列比较分析结果显示，IBDV DK 分离株VP2 基因序列与参考株相应基因的同源性为 93.1 %～97.0 %，其中 DK 株与Cu-1wt 参考株(经典株)VP2 基因序列同源性最高为97.0 %。其氨基酸序列比较分析结果也与Cu-1wt 同源性最高为97.5 %。VP2 基因推导的氨基酸序列构建系统发育树结果显示，DK 株与Cu-1wt 参考株处在同一分支；DK 株与 Cu-1wt、OKYM、UK661、MB 等参考株亲缘关系较近；与Edgar 参考株亲缘关系相对较远(图3)。

图3 IBDV DK 株与各参考株VP2 基因推导氨基酸序列的遗传进化关系Fig.3 Genetic evolution relationship based on the deduced amino acid sequences of VP2 gene in DK strain

比较DK 株与不同毒力代表株VP2 基因推导氨基酸序列中的代表性氨基酸位点的差异，结果显示，DK 株的 249Q、253Q、279D、284A、290M、313V、330S 与超强毒株HLJ0504 与UK661、强毒株Cu-1wt 与Edgar 的氨基酸位点一致，且DK 株的七肽区也为 SWSASGS；但 DK 株的 222P、242Q、256V、294I、299 N 与中等毒力病毒株的氨基酸位点一致；222P、256V、299N 这3 个氨基酸位点不符合IBDV 超强毒株的特征[6]；而其在222P、249Q位与抗原变异株的222T 和249K 也不相同。表明DK 株具有中等毒力病毒株的特性又具有部分超强毒株的特性。

综上所述，DK 株的毒力与Cu-1wt 标准强毒株同源关系最近，且DK 株既具有中等毒力病毒株的特性又具有部分超强毒株的特性；再结合IBDV DK株对SPF 雏鸡的致病性结果，表明IBDV DK 分离株为中等偏强毒力病毒株。