正交试验法优选壮药藤苦参的提取工艺

谭安蔷，李芳婵，吴玉强，罗宇东

（1.广西中医药大学制药厂，广西 南宁 530023；2.广西中医药大学，广西 南宁 530200）

壮药藤苦参（Streptocaulon grif fithii Hook.f.）为萝摩科（Asclepiadaceace）植物马莲鞍的干燥根，别名为古羊藤、老鸦咀、毛青才、南苦参、奶藤、马达、红马连鞍、虎阴藤、老鸦嘴，具有清热解毒、散瘀止痛、抗肿瘤的功效，对感冒发热、跌打损伤等有一定的疗效［1-2］。藤苦参属大宗壮瑶药材，为外感风痧颗粒（片）的主要药材之一。目前对藤苦参的研究多集中在化学成分上，其主要成分为皂苷类和强心苷类，而对其提取工艺研究甚少［2-8］。本文以总皂苷提取量和得膏率为评价指标，采用正交试验法对藤苦参的提取工艺进行优选。

1 实验材料

1.1 药材与试剂 藤苦参购自南宁市景昌中药饮片有限公司（批号:20160401），经广西中医药大学韦松基教授鉴定为藤苦参，符合《广西壮族自治区壮药材质量标准汇编》（第1卷）中藤苦参的药材标准［9］；人参皂苷Re对照品由中国食品药品检定研究院提供（批号:110704-201424）；其余所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器 752型紫外-可见分光光度计（上海舜宇恒平仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 总皂苷含量测定方法考察

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Re标准品适量，置于10 ml的容量瓶，加80%甲醇配制成0.60 mg/ml的人参皂苷Re对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取过4号筛的藤苦参粗粉5 g，加10倍量的95%乙醇，于85℃水浴中回流提取2次，每次80 min，合并提取液，于85℃水浴浓缩至无醇味，烘干，即得藤苦参提取物粗品，干膏得率为11.2%。取上述提取物粗品112 mg（相当于生药材1 g），置于10 ml量瓶中加80%甲醇溶解并定容，取上述溶液1 ml置于10 ml容量瓶中，加80%甲醇定容至刻度线，即得。

2.1.3 标准曲线制备 取人参皂苷Re对照品溶液60 μl、90 μl、120 μl、150 μl、180 μl、210 μl，置于干燥具塞试管中，挥干，分别加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 ml，高氯酸0.8 ml，置于60℃水浴中15 min，取出，流水冷却1 min，分别加入冰醋酸5 ml，摇匀，以随行试剂作空白，于550 nm处测定吸光度（A），以吸光度A为纵坐标，质量浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，见图1。结果线性方程为A=15.552C+0.0009（r2=0.9999），线性范围 6～21 μg/ml。

图1 人参皂苷Re对照品标准曲线

2.1.4 精密度考察 取对照品溶液20 μl置于干燥具塞试管中，挥干，按“2.1.3项”方法测定吸光度（A），连续测定6次，以吸光度（A）计算，求得RSD=1.3%，结果表明仪器精密度良好。

2.1.5 重复性考察 取同一批样品（6份）的供试品溶液20 μl，按“2.1.3项”方法测定吸光度，计算RSD为1.5%，显示该方法重复性良好。

2.1.6 稳定性考察 精密吸取供试品溶液20 μl，按“2.1.3项”下方法处理，在0 min，15 min，30 min，60 min，90 min，120 min时测定吸光度，计算得RSD为1.7%，说明供试品溶液显色后在120 min内稳定。

2.1.7 加样回收率考察 取已知总皂苷含量的藤苦参提取物适量（6份），精密称定，置于10 ml容量瓶中，加入人参皂苷 Re对照品溶液（0.60 mg/ml）8.7 ml，加80%甲醇定容至刻度线，按“2.1.2项”方法制备供试品溶液，按“2.1.3项”方法测吸光度，计算得平均回收率为99.92%，RSD=1.56%，结果见表1。显示本法测定的结果准确可信。

表1 加样回收率试验结果 （n=6）

2.1.8 样品含量测定 精密取6批干膏样品适量，按“2.1.2项”方法制备供试品溶液，分别取供试品溶液20 μl置于干燥具塞试管中，按“2.1.3项”方法测定吸光度，计算总皂苷含量，结果RSD为0.38%。见表2。

表2 6批样品含量测定结果 （n=6）

2.2 提取工艺优化 参考文献［10-13］选择溶剂量、提取时间和提取次数为考察因素（表3），以干膏得率和总皂苷提取量为指标进行评价。取过4号筛的藤苦参粉末5 g（共9份），按L9（34）正交表（表4）完成9组试验，按“2.1.2项”方法制备供试品溶液，按“2.1.3项”方法测定吸光度，计算总皂苷提取量。取9组提取液适量，置于已经在105℃干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，按《中华人民共和国药典》2015版（四部）总浸出物的测定方法测定得膏率。得膏率=干膏质量/水提液质量×100%。正交试验结果见表4，方差分析见表5、表6。

表3 试验因素与水平列表

表4 正交试验方案设计和结果

表5 得膏率方差分析

表6 总皂苷提取量方差分析

表4结果显示，以干膏得率为指标，3个因素的R大小顺序为:C＞B＞A，最佳工艺组合为 A3B3C2；以总皂苷提取量为指标，3个因素的R值大小顺序为:B＞C＞A，最佳工艺组合为A2B3C2。以空白为误差列分别对得膏率、总皂苷提取量进行方差分析，发现乙醇用量（B）、提取次数（C）对得膏率、总皂苷提取量影响显著（P＜0.05），提取时间（A）对得膏率无显著性影响。综合考虑得膏率、总皂苷的提取结果，确定藤苦参最佳提取工艺参数为A2B3C2:提取时间60 min，溶剂量10倍，提取次数2次。

2.3 验证试验 取过4号筛的藤苦参粉末5 g，共3份，按上述优选的工艺参数A2B3C2进行验证试验，测定得膏率和皂苷含量，结果藤苦参中总皂苷含量为95.00 mg/g，得膏率为9.5%，结果表明该工艺稳定可行、重复性好，见表7。

表7 验证试验结果

3 讨 论

皂苷在自然界中分布广泛，资源丰富，结构多样，具有抗炎、抗肿瘤、提高动物免疫力、抗氧化等作用，药用价值高，具有一定的开发潜力［10］。藤苦参属广西特色壮瑶药材，也是广西中医药大学制药厂产品外感风痧颗粒的主药之一，但目前对于其提取工艺研究不足。根据文献报道，藤苦参主要含有皂苷和强心苷类等生物活性的重要成分［10-12］。通过文献研究［13-14］选择乙醇为藤苦参总皂苷的提取溶剂，预试验发现95%乙醇提取率最高，因此本文选择95%为提取溶剂，考察乙醇用量、时间、次数对藤苦参总皂苷提取的影响，最终优选出藤苦参总皂苷提取工艺为提取时间60 min，溶剂量10倍，提取次数2次。所优选的提取工艺稳定、合理，有效成分提取率高，可为今后藤苦参的开发利用提供一定的理论基础。