ANGPTL 3和ECE-1在食管癌患者中的表达及临床意义

刘仲阳，袁欣

（保定市第二中心医院 胸外科，河北 保定 072750）

食管癌（esophageal carcinoma,EC）是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，据统计，2012年全球EC 的新发病例约45.6 万，死亡病例约40.0 万[1]。我国EC的发病率居世界首位，每年约有25.9 万新发病例，21.1 万死亡病例[2]。近年来，EC 的诊断和治疗取得了较大进展，然而EC 患者的预后仍不乐观，其5年生存率仅25%左右[3]。侵袭和转移是导致EC 患者不良预后的主要原因[4]，而新生血管形成在EC 侵袭转移过程中发挥重要作用。血管生成素样蛋白（angiopoietinlike protein,ANGPTL）是一类分泌型糖蛋白，其结构类似于血管生成素，而功能与血管内皮生长因子相似，ANGPTL 3 可诱导新生血管形成[5]，进而促进肿瘤生长和侵袭。目前关于ANGPTL 3 的研究尚处于初始阶段，且ANGPTL 3 在EC 发生、发展过程中的作用所知甚少。内皮素（Endothelin,ET）系统高度活化与肿瘤新生血管形成密切相关[6]，内皮素转化酶（endothelinconverting enzyme,ECE）可裂解前体ET，进而激活ET 系统。有研究证实，内皮素转化酶-1（endothelinconverting enzyme-1,ECE-1）可诱导前列腺癌细胞发生侵袭[7]。本研究旨在检测ANGPTL 3、ECE-1 在EC组织中的表达情况，分析其表达对EC 患者病情预测及预后判断的应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2011年1月—2013年1月保定市第二中心医院行切除手术的EC 患者的癌组织及其癌旁正常组织的石蜡标本。纳入标准：①具备完整的病历资料；②术前未接受放化疗；③术后经病理诊断证实为EC；④均签署知情同意书。排除标准：①严重肝肾功能不全；②合并全身性感染；③合并其他恶性肿瘤等。共选取95 例EC 患者。其中，男性49 例，女性46 例；年龄＜60 岁患者65 例，≥60 岁患者30 例；中高分化程度 72 例，低分化程度23 例；肿瘤直径＜5 cm 58 例，肿瘤直径≥5 cm 37 例；有淋巴结转移52 例，无淋巴结转移43 例；有远处转移34 例，无远处转移61 例；TNM分期，Ⅰ、Ⅱ期75 例，Ⅲ、Ⅳ期20 例。研究经本院医学伦理委员会审核通过。

1.2 免疫组织化学法检测ANGPTL 3、ECE-1 的表达

取EC 组织和癌旁正常组织的石蜡标本，常规二甲苯脱蜡、浸泡水化（依次为100%、95%、80%和70%酒精）后，蒸馏水清洗3 次，每次3 min；滴加3% H2O2，孵育10 min，灭活内源性过氧化物酶，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3 次，每次3 min；枸橼酸钠溶液（10 mmol/L，pH 6.0），加热至100℃，持续10 min，逐渐冷却至室温，进行抗原修复，PBS 洗涤3 次，每次3 min；滴加羊血清工作液，37℃封闭10 min，弃去血清；分别滴加ANGPTL 3、ECE-1 一抗工作液，4℃孵育过夜，PBS 洗涤3 次，每次3 min；滴加生物素二抗，室温孵育30 min，PBS 洗涤3 次，每次3 min；滴加新鲜配制的DAB 溶液，进行显色反应，蒸馏水清洗3 次，每次3 min；苏木精-伊红染色法复染，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。结果判定：ANGPTL 3、ECE-1 主要定位于细胞质。光学显微镜下，随机选取10 个高倍视野，每个视野计数100 个肿瘤细胞。阳性细胞百分比：＜5%为0 分；6%～25%为1 分；26 %～50% 为2 分；51%～75% 为3 分；＞75%为4 分。着色强度：黄色为1 分；棕黄色为2 分；棕褐色为3 分。根据阳性细胞百分比评分与着色强度评分的乘积进行结果判定，5～12 分为阳性表达，0～4 分为阴性表达。

1.3 术后随访

以患者术后为起点，通过电话、门诊等方式对患者及其家属进行随访，随访时间为手术后1～60 个月，直至患者死亡或者随访时间结束。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件。计数资料以例或率（%）表示，两样本间阳性率的比较分别采用χ2检验，两蛋白表达水平间的相关性采用Pearson 相关分析，EC 患者预后的影响分析采用Kaplan Meier 法、Log-rank χ2检验及Cox 比例风险回归模型，对各组生存率曲线分布进行分析，P＜0.05 为差异有统计学 意义。

2 结果

2.1 ANGPTL 3、ECE-1 在不同食管组织中的表达情况

EC组织中ANGPTL 3的阳性表达率与癌旁正常组织比较，差异有统计学意义（χ2=73.889，P=0.000），EC 组织[63.16%（60/95）]高于癌旁正常组织[4.21%（4/95）]；EC 组织中ECE-1 的阳性表达率与癌旁正常组织比较，差异有统计学意义（χ2=66.193，P=0.000）；EC 组织[53.68%（51/95）]高于癌旁正常组织[1.05%（1/95）]。见图1、2。

2.2 EC 组织中ANGPTL 3、ECE-1 表达与患者临床病例特征的关系

EC 组织中，ANGPTL 3 表达与患者年龄、性别、肿瘤分化程度、淋巴结转移、远处转移及TNM 分期均无关（P＞0.05），而与肿瘤直径相关（P＜0.05）。ANGPTL 3 在肿瘤直径≥5cm 的EC 组织中的阳性表达率为78.38%（29/37），高于在肿瘤直径＜5 cm 的EC组织中的阳性表达率[53.45%（31/58）]（P＜0.05）；ECE-1 表达与患者年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤直径、淋巴结转移及TNM 分期均无关（P＞0.05），而与远处转移相关（P＜0.05）。ECE-1 在有远处转移的EC 组织中的阳性表达率为76.47%（26/34），高于无远处转移的EC 癌组织中的阳性表达率[40.98%（25/61）]（P＜0.05）。见表1。

2.3 EC 组织中ANGPTL 3 与ECE-1 表达的相关性

Pearson 相关分析结果显示，在EC 组织中，ANGPTL 3与ECE-1表达呈正相关（r=0.610，P=0.000）（见表2）。相关散点数据见图3。

2.4 EC 组织中ANGPTL 3、ECE-1 表达对患者预后的影响

根据EC 组织中ANGPTL 3表达情况，将EC患者分为ANGPTL 3阳性表达组和ANGPTL 3 阴性表达组，ANGPTL 3 阳性表达组术后5年总生存率与ANGPTL 3 阴性表达组比较，差异有统计学意义（χ2=29.760，P=0.000），ANGPTL 3 阳性表达组[25.00%（15/60）]低于ANGPTL 3阴性表达组[82.86%（29/35）]。Log-rank χ2检验结果显示，ANGPTL 3 阳性表达组的平均生存时间与ANGPTL 3阴性表达组比较，差异有统计学意义（χ2=26.979，P=0.000），ANGPTL 3 阳性表达组[（40.35±2.43）个月]低于ANGPTL 3 阴性表达组[（56.17±1.59）个月]（见图4A）。

图1 EC 组织中ANGPTL 3、ECE-1 的表达情况 （苏木精-伊红 ×200）

根据EC 癌组织中ECE-1 表达情况，将EC 患者分为ECE-1 阳性表达组和ECE-1 阴性表达组，ECE-1 阳性表达组的术后5年总生存率与ECE-1 阴性表达组比较，差异有统计学意义（χ2=7.464，P=0.006），ECE-1 阳性表达组[33.33%（17/51）]低于 ECE-1 阴性表达组[61.36%（27/44）]。Log-rank χ2检验结果显示，ECE-1 阳性表达组的平均生存时间与ECE-1 阴性表达组比较，差异有统计学意义（χ2=9.788，P=0.002），ECE-1 阳性表达组[（40.43±2.67）个月]低于ECE-1 阴性表达组[（52.84±2.00）个月]（见图4B）。

表1 患者临床病例特征与EC 组织中ANGPTL 3、ECE-1 表达的关系 例

表2 EC 组织中ANGPTL 3、ECE-1 表达的相关性 例

图3 EC 组织中ANGPTL 3、ECE-1 表达相关性散点图

2.5 EC 生存预后的影响因素分析

以本研究95 例患者资料为样本，以EC 生存预后状态为应变量（赋值：1=死亡，0=生存，t=生存期），建立Cox 比例风险模型。自变量为EC 组织中ANGPTL 3、ECE-1 表达。此外，加上单因素分析中 α入=0.10 的指标，如肿瘤分化程度、远处转移、肿瘤直径及TNM 分期等指标/因素，回归过程采用后退法，自变量退出α出=0.05。回归结果：远处转移及ANGPTL3、ECE-1 表达均被保留入回归模型（P＜0.05），相对危险度为1.6～2.3，提示远处转移，ANGPTL 3、ECE-1 表达阳性是影响EC 生存预后的危险因素。见表3。

图4 EC 组织中ANGPTL 3、ECE-1 表达对患者预后的影响

表3 EC 生存预后的影响因素Cox 分析结果

3 讨论

目前发现的ANGPTL 家族蛋白共有8 种，分别命名为ANGPTL 1～8，且不同ANGPTL 蛋白在功能上表现出多样性，如ANGPTL 1 在炎症、脂肪代谢中发挥作用，而ANGPTL 3 参与调节胰岛素抵抗、脂肪代谢等[8]。ANGPTL 3 基因定位于染色体1p31，编码由460 个氨基酸组成的分子量约为70 kD 的分泌型蛋白，ANGPTL 3 在肝脏组织中特异性表达，而在其他组织中的表达量极少[9-10]。目前，关于ANGPTL 3与肿瘤的关系的研究较少，KOYAMA 等[11]在口腔癌中的研究发现，ANGPTL 3 呈高表达状态，且与肿瘤大小呈正相关。而本研究中，与癌旁正常组织比较，ANGPTL 3 在EC 癌组织中的表达增加，且肿瘤直径越大，ANGPTL 3 阳性率越高，提示ANGPTL 3 可能参与了EC 肿瘤形成。同时ANGPTL 3 高表达可促进肿瘤生长，新生血管形成是实体肿瘤生长必备条件，推测ANGPTL 3 可能通过诱导新生血管形成，进而促进肿瘤生长。CAMENISCH 等[5]证实ANGPTL 3 与整合素αvβ3 受体结合，可刺激血管生成，进而诱导内皮细胞的黏附和迁移。近年来，关于ANGPTL 3 促进新生血管形成的机制研究并未取得突破性进展，本研究将在后续工作中对其内在机制进行深入探究。

ET-1 是一种内源性生物多肽，具有强大的收缩血管作用，在调节微循环灌流及血管张力方面发挥非常重要的作用，ECE-1 可裂解前体ET-1，生成成熟的ET-1，进而参与机体的生理病理过程[12-13]。大量研究证实，ECE-1 在子宫内膜癌[14]、前列腺癌[15]、肺癌等[16]多种肿瘤细胞中表达增加，而关于ECE-1 在肿瘤细胞中所发挥的功能及其高表达的临床意义的报道较少，如SMOLLICH 等[17]发现，在乳腺癌患者中，ECE-1 高表达与高复发率密切相关。本研究结果显示，ECE-1在EC 组织中具有较高的阳性表达率，且ECE-1 高表达与肿瘤发生远处转移相关，提示ECE-1 在EC 发生和恶性进展（远处转移）中发挥促进作用。体外细胞水平的研究结果表明，ECE-1 能够促进口腔鳞癌细胞增殖[18]、增强前列腺癌细胞[19]和卵巢癌细胞[20]的侵袭能力，以上研究结论与本研究的临床病例研究结果，共同证实ECE-1 参与并促进肿瘤发生侵袭转移，本研究推测ECE-1 可能通过激活ET 系统，参与调节肿瘤新生血管形成过程，进而为肿瘤发生侵袭转移提供条件，其内在机制将在后续工作中进行深入探索。

以上结果提示，ANGPTL 3 和ECE-1 可能在新生血管形成过程中均发挥促进作用，本研究进一步地分析ANGPTL 3 与ECE-1 表达之间的相关性，Pearson相关分析结果显示，在EC 癌组织中ANGPTL 3 与ECE-1 表达之间呈正 相 关，提示ANGPTL 3 与ECE-1 在EC 肿瘤形成、肿瘤生长及恶性进展过程中可能发挥协同作用，共同诱导肿瘤新生血管形成。而Kaplan Meier 法的分析结果显示，ANGPTL 3 阳性表达及ECE-1 阳性表达，均可能预示着患者较低的术后总生存率和较短的平均生存时间，提示ANGPTL 3 和ECE-1 高表达与EC 患者不良预后密切相关。此外，Cox 回归分析也证实：ANGPTL 3 阳性表达及ECE-1阳性表达，均是EC 患者生存预后的危险因素。当然，由于本研究中的样本数量有限，为得到更确切的结论，后期将继续扩大样本量进行统计分析。

综上所述，本研究发现在EC 组织中，ANGPTL 3和ECE-1 均具有较高的阳性表达率，均与患者较差的病理特征、不良预后相关，且ANGPTL 3 与ECE-1表达之间呈正相关，提示ANGPTL 3 和ECE-1 可能在EC 发生、发展过程中发挥协同作用，且均具有作为EC 患者病情评估、预后判断及治疗靶点的潜能。