植物乳杆菌MXG-68所产细菌素的抑菌特性分析

满丽莉，向殿军

1(内蒙古民族大学 生命科学学院，内蒙古 通辽，028042)2(内蒙古民族大学 农学院，内蒙古 通辽，028042)

食品安全是人类健康的重要保证，食品腐败变质不仅会造成巨大的经济损失，而且会导致严重的疾病[1]。鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、志贺氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等是引起食品腐败变质和食物中毒的主要原因[2]。新型生物防腐剂-乳酸菌细菌素的应用有利于抑制微生物污染、延长食品货架期、改善食品质量和提升食品安全[3]。但目前商品化的乳酸菌细菌素的数量极其有限，抑菌谱窄和抑菌特性不稳定是影响乳酸菌细菌素应用的主要原因之一，筛选出广谱且抑菌特性稳定的乳酸菌细菌素是亟待解决的问题。

植物乳杆菌作为一种乳酸菌细菌素生产菌株具有许多优势，其来源广泛，可从牛乳、肉及肉制品、奶酪、面团、发酵黄瓜、橄榄菜、酸菜、果汁等食物中分离筛选，安全性高[4]。相关报道显示，某些植物乳杆菌所产的细菌能有效地抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌(包括致病菌和腐败菌)，同时具有较好的稳定性，例如：plantaricin KL-1Y、plantaricin LpU4和plantaricin MG[5-7]。鉴于植物乳杆菌细菌素的广谱抑菌活性和各种环境下的稳定性，其在食品防腐及食品安全方面具有潜在的应用前景。

本研究以内蒙古自治区的酸马奶中筛选到的植物乳杆菌所产的细菌素为研究对象，对其抑菌谱、作用方式、分子质量及对温度、pH、有机溶剂、表面活性剂的耐受性进行分析。明确该细菌素的抑菌特性，有利于其作为一种新型的生物防腐剂更好地应用于食品中，为更好地实现细菌素的开发及应用提供一定的理论依据和方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试样品及模式菌株

植物乳杆菌MXG-68分离于内蒙古地区的酸马奶中，由实验室自行保存。指示菌株分别购自中国药品生物制品检定所、中国普通微生物菌种保藏管理中心、美国模式培养物研究所及波斯模式培养物研究所。

1.1.2 试剂、培养基及主要仪器设备

培养基，购自英国Oxoid公司；过氧化氢酶，购自美国Sigma公司；Marker，购自宝生物工程(上海)有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

MJ-54A/MJ-78A型STIK灭菌锅，北京天赐科仪商贸有限公司；Microfuge16型离心机，美国贝克曼公司；110-801型三量ip67防水原点数显卡尺不锈钢零点电子游标尺，东莞市景有模具五金有限公司；DYY-10C型电泳仪、DYCZ-28A型电泳槽，北京市六一仪器厂；1708195型凝胶成像系统，伯乐(Bio-Rad)公司。

1.2 方法

1.2.1 培养及发酵方法

植物乳杆菌MXG-68的培养方法：挑取菌株接种于装有100 mL MRS培养基(pH 5.8)的250 mL锥形瓶中，37 ℃培养至约109CFU/mL。

植物乳杆菌MXG-68的发酵方法：将菌液按1%接种于装有100 mL MRS培养基(pH 5.8)的250 mL锥形瓶中，30 ℃发酵24 h。

指示菌的培养方法：挑取指示菌接种于装有100 mL 培养基的250 mL锥形瓶中，37 ℃培养至约107CFU/mL。植物乳杆菌、清酒乳杆菌及嗜酸乳杆菌用MRS培养基；乳酸乳球菌用M17培养基；产气荚膜梭菌及生孢梭菌用RCM培养基；单核细胞增生李斯特氏菌用TSA-YE培养基；粪肠球菌、铜绿假单胞菌及肠炎沙门氏菌用LB培养基；其他指示菌均用NB培养基。

1.2.2 发酵上清液的制备及抑菌活性的测定

部分纯化细菌素的分子质量通过SDS-PAGE测定[8]。电泳结束后，一块胶用考马斯亮蓝R250染色，染色约20 min后用脱色液振荡过夜脱色。另一块胶用无菌水清洗后，覆盖于含鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028(107CFU/mL)的NB半固体培养基上，于37 ℃培养12 h观察特异性条带处是否出现抑菌圈。

1.2.3 植物乳杆菌MXG-68的抑菌谱测定

按照1.2.1、1.2.2中的方法制备发酵上清液，测定其对29株指示菌的抑菌活性，确定植物乳杆菌MXG-68所产细菌素的抑菌谱。

1.2.4 细菌素的作用方式测定

指示菌蜡样芽孢杆菌ATCC 11788和鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028分别培养4 h，2株菌的菌液分别分成100 mL的两等份，一份作为对照，一份加入部分纯化的细菌素(质量浓度0.5 g/L)，于37 ℃培养14 h， 每隔1 h取样测定指示菌的活菌数(CFU/mL)和菌体密度(OD600)，分析细菌素对指示菌的作用方式是杀菌、溶菌，还是抑菌。

1.2.5 细菌素的分子质量测定

部分纯化细菌素的分子质量通过SDS-PAGE测定[8]。出现特异条带部分的胶体用无菌水清洗后，覆盖于含鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028(107CFU/mL)的NB半固体培养基上，于37 ℃培养12 h观察是否出现抑菌圈。

1.2.6 细菌素对温度、pH、有机溶剂和表面活性剂的耐受性测定

按照1.2.1、1.2.2中的方法制备发酵上清液，用于细菌素耐受性的研究。5 mL的发酵上清液分别于60、80、100、121 ℃处理30 min，4、-20 ℃处理30 d，温度恢复到室温后测定抑菌活性，以鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028作为指示菌，对照为室温下未经处理的发酵上清液，确定细菌素的温度耐受性。

用1 mol/L的HCl或NaOH将发酵上清液的pH分别调至1.0～10.0，于37 ℃处理2 h后，将pH重新调至7.0测定抑菌活性，以鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028作为指示菌，对照为37 ℃处理2 h未调整pH的发酵上清液，确定细菌素的pH耐受性。

发酵上清液分别添加1%(体积分数)的乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈，1 g/L的Tween-80、Tween-20、Triton X-100及0.1、1.0、5.0 g/L的EDTA，于37 ℃处理2 h后测定抑菌活性，以鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028作为指示菌，对照为37 ℃处理2 h的未添加有机溶剂和表面活性剂的发酵上清液，确定细菌素对有机溶剂和表面活性剂的耐受性。

1.2.7 数据分析

所有的试验均重复3次，采用Excel进行标准偏差计算，结果用平均值±标准偏差来表示。应用SPSS 17.0软件对试验数据进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌MXG-68抑菌谱

大部分植物乳杆菌所产的细菌素只能抑制革兰氏阳性菌，如plantaricin W、乳杆菌LL441所产的plantaricin C、plantaricin D及plantaricin T，某些植物乳杆菌可产广谱细菌素[9-10]。植物乳杆菌MXG-68所产的细菌素不但对金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌、生孢梭菌、单核细胞增生李斯特氏菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、痢疾志贺氏菌、藤黄微球菌等革兰氏阳性菌具有抑菌作用，而且对大肠杆菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏杆菌、肠炎沙门氏菌等革兰氏阴性菌亦具有抑制作用(表1和图1)，是一种可抑制常见食品腐败菌和致病菌的广谱细菌素。此结果与MAN、AGALIYA、YU的研究相一致[11-13]。

表1 植物乳杆菌所产细菌素对指示菌的抑菌活性Table 1 The activity of bacteriocins produced by L. plantarum MXG-68 based on indicator strains

注：aNB:营养肉汤培养基; RCM:强化梭菌培养基; TSA-YE:含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂; MRS:De man-Rogosa-Sharpe medium的缩写; LB:9Luria-Bertani medium的缩写；bG+:革兰氏阳性菌; G-:革兰氏阴性菌；cATCC:美国模式培养物研究所; PTCC:波斯模式培养物研究所Type Culture Collection; NICPBP:中国药品生物制品检定所; CGMCC:中国普通微生物菌种保藏管理中心。“-”表示未检出。

a-为鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028;b-葡萄球菌ATCC12600; c-枯草芽孢杆菌ATCC6051图1 植物乳杆菌MXG-68所产细菌素对指示菌的抑菌圈Fig.1 Inhibition zone of bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum MXG-68 on indicator strains

2.2 细菌素的作用方式

图2表明植物乳杆菌MXG-68所产细菌素对蜡样芽孢杆菌ATCC 11788(革兰氏阳性菌)和鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028(革兰氏阴性菌)的作用方式。与对照组相比，加入细菌素后(5～14 h)蜡样芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的活菌数显著降低(P<0.01)。加入细菌素后(5～14 h)蜡样芽孢杆菌ATCC 11788和鼠伤寒沙门氏菌菌液的OD600变化不明显(P>0.05)，而对照组菌液的OD600持续上升。细菌素导致蜡样芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏菌活菌数减少，说明细菌素的作用方式是杀菌，而OD600未降低，菌液中总菌数基本保持不变，说明作用方式不是溶菌。

a-为蜡样芽孢杆菌ATCC 11788；b-鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028图2 植物乳杆菌MXG-68所产细菌素对蜡样芽孢杆菌ATCC 11788和鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028活菌数及菌体密度的影响Fig.2 Effects of bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum MXG-68 on viable cell numbers and cell densities of Bacillus cereus ATCC 11788 and Salmonella Typhimurium ATCC 14028

2.3 细菌素的分子质量

SDS-PAGE结果显示在约6.5 ku获得一条清晰的条带，抑菌试验表明该条带对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028具有抑菌活性(图3)。植物乳杆菌MXG-68所产细菌素的分子质量与GUPTA等的研究结果相一致[14]，而与KUMAR等(约6 ku)[15]、李景良(约4 ku)[16]和鲁渊(约5 ku)[17]的研究结果不同，植物乳杆菌分子质量的差异可能是由于菌株差异所造成的。

图3 SDS-PAGE分析及抑菌活性检测Fig.3 Tricine-SDS-PAGE analysis and determination of antibacterial activity注：1-部分纯化细菌素的分子质量；2-细菌素对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的抑菌圈，箭头表示抑菌圈。

2.4 细菌素的温度耐受性

食品在加工、运输、销售和贮藏过程中，无法避免地会遇到各种高温和低温环境，较好的温度耐受性是细菌素被广泛应用于食品中的前提条件之一。由图4可知，60、80、100、121 ℃处理30 min导致细菌素的抑菌活性有所降低，但影响不显著(P>0.05)，抑菌活性均保留97.69%以上，结果表明植物乳杆菌MXG-68所产细菌素具有较高的温度耐受性，此研究结果与植物乳杆菌F1所产细菌素相类似[18]。同时，细菌素在冷藏温度4 ℃和冷冻温度-20 ℃条件下处理30 d，抑菌活性保留近100%。

图4 温度对抑菌活性的影响Fig.4 Effect of temperature on the antibacterial activity

2.5 细菌素的pH耐受性

由图5可知，细菌素在pH 1～10均表现出抑菌活性，最高抑菌活性出现在pH=6。与对照组相比，当pH=1～2时抑菌活性极显著性降低(P<0.01)，pH=3或10时抑菌活性显著性降低(P<0.05)，pH=4～9时对抑菌活性影响不显著(P>0.05)，但抑菌活性均保留94.55%以上，说明植物乳杆菌MXG-68所产细菌素具有较好的酸碱耐受性。此结果与以前的部分研究结果不同，细菌素仅在酸性环境下有抑菌活性，而在中性和碱性环境下抑菌活性丧失[19-20]。细菌素的pH耐受性强有助于其在食品加工和进入人体过程中，最大程度地保留其抑菌活性，有利于更好地延长保质期及发挥益生特性。

图5 不同pH对抑菌活性的影响Fig.5 Effect of different pH vaule on the antibacterial activity

2.6 有机溶剂对细菌素活性的影响

由图6可知，与对照组相比，乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈导致植物乳杆菌MXG-68所产细菌素的抑菌活性稍有降低，但影响不显著(P>0.05)。经不同的有机溶剂处理后，抑菌活性保留近100%，具有较好的化学稳定性，结果表明细菌素可在纯化的不同阶段维持其固有的结构和功能，有利于细菌素的提取及广泛应用。

图6 有机溶剂对抑菌活性的影响Fig.6 Effect of organic solvents on the antibacterial activity

2.7 表面活性剂对细菌素活性的影响

由图7可知，与对照组相比，Tween-80、Tween-20和Triton X-100对植物乳杆菌MXG-68所产细菌素的抑菌活性基本无影响(P>0.05)。EDTA有利于提高细菌素的抑菌活性，且1 g/L和5 g/L EDTA能显著提高抑菌活性(P<0.01)，此结果与黎杰、滕志利的研究结果相一致[21-22]。对于革兰氏阴性菌，EDTA增强抑菌活性主要原因在于其可发挥外膜渗透剂的作用，络合脂多糖维持其结构所需的Ca2+，破坏其结构；而对于革兰氏阳性菌的抑制作用主要是在于其可与金属离子螯合[23]。

图7 表面活性剂对抑菌活性的影响Fig.7 Effect of surfactants on the antibacterial activity

3 结论

酸马奶来源的植物乳杆菌MXG-68所产的细菌素以杀菌的方式同时抑制常见的易导致食品腐败变质和食物中毒的微生物，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，是一种分子质量约6 ku的广谱细菌素，其在高温、冷藏、冷冻、酸性、中性、碱性条件下均较稳定，且有机溶剂及表面活性剂对细菌素的抑菌活性基本无影响，而EDTA有利于提高抑菌活性，说明该细菌素的稳定性较高，在应对食品加工、贮藏、运输、销售过程中能最大程度地保留抑菌活性，延长食品的货架期，为更好地实现细菌素的开发及应用提供一定的理论依据。随着转录组学、基因组学及蛋白组学的不断发展，可更加透彻地掌握乳酸菌细菌素合成相关基因、调控机制及代谢通路，有利于更加有效的应用乳酸菌细菌素。