怀菊花不同商品规格的质量评价分析△

苏迪，刘晓薇，陈随清

河南中医药大学 药学院，河南 郑州 450046

怀菊花为“四大怀药”之一，为菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序，具有平肝明目、清热解毒的功效[1]。怀菊花主产于河南省焦作地区，又以温县和武陟县种植较多，化学成分主要有有机酸、黄酮类及挥发油等，《中华人民共和国药典》2015版项下设绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸作为其指标成分。现代药理表明，菊花具有抗炎、降压、抗衰老、抗肿瘤等作用[2-7]。怀菊花作为河南特有的道地药材之一，具有很大的市场价值，而随着中药材交易的不断变化，人们对于中药材的广泛认知及应用，中药材的商品规格等级已然发生改变，目前市场上主要有大白菊、小白菊、小黄菊和珍珠菊4种商品规格的怀菊花栽培品种[8-10]。而对其商品规格等级的划分可追溯到1984年国家中医药管理局与卫生部联合下达的《76种药材商品规格标准》，其中将怀菊花仅分为两个等级[11]，随着现代化检测技术和科学评价方法的运用，旧的标准已然无法满足市场需求，停滞的标准研究不利于药材市场的健康发展，因此急需确定新的商品标准。本课题组通过到怀菊花的产地和药材市场进行实地考察和走访，收集到32批怀菊花样品，根据文献和市场调查结果，将怀菊花分为4个商品规格，采用内在指标成分对其质量进行评价，为怀菊花的商品规格与其质量的内在联系奠定基础，为怀菊花的商品规格等级的制定提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪(2998紫外检测器)；岛津UV-2600紫外分光光度计；KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q Academic A10超纯水机；BSA124S-分析天平(赛多利斯公司)。

1.2 试药

绿原酸对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：16031610，纯度99.39%)、木犀草苷对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：5373-11-5，纯度≥98%)、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：111782-201405，纯度92%)；芦丁(中国食品药品检定研究院，批号：153-18-4，纯度≥98%)；磷酸、甲醇、乙腈(赛默飞世尔科技有限公司，色谱纯)；水为实验室自制重蒸水；其他试剂均为分析纯。

怀菊花样品收集于河南省武陟县、温县及河北安国、四川等地，经河南中医药大学陈随清教授鉴定，均为菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序。样品信息见表1。

表1 怀菊花样品信息

2 方法与结果

2.1 绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品适量，配制成质量浓度为358、286、849 μg·mL-1的溶液；精密吸取各母液适量，加70%甲醇水定容，配制成一系列不同浓度的混合对照品溶液，4 ℃保存，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 取干燥的供试品，粉碎过一号筛，精密称定0.25 g，置干燥的50 mL具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇水25 mL，精密称定，超声处理40 min，冷却，用70%甲醇水补足减失的质量，摇匀，取续滤液，过0.22 μm微孔滤膜，备用。

2.1.3 色谱条件 Waters XBridge C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱(0～11.0 min，10%～18%乙腈；11.0～30.0 min，18%～20%乙腈；30.0～40.0 min，20%乙腈)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：348 nm；进样量：10 μL；运行时间：40 min，HPLC图见图1。

2.1.4 线性范围考察 精密吸取不同浓度的绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸混和对照品10 μL，按上述色谱条件测定，以浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，得到绿原酸回归方程Y=10 410X+1 842.2(r=0.999 8)，线性范围为3.69～92.25 μg·mL-1；木犀草苷回归方程Y=26 451X-22 972(r=0.999 9)，线性范围为2.65～53.00 μg·mL-1；3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸回归方程Y=18 111X-320.06(r=0.999 9)，线性范围为8.33～249.90 μg·mL-1。

2.1.5 精密度试验 按2.1.2项下条件制备怀菊花供试品溶液(Y14)，精密吸取10 μL，连续测定6次，记录峰面积，计算绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的RSD值分别为0.92%、1.31%、1.51%，表明仪器的精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一怀菊花供试品溶液(Y14)，分别于0、2、4、8、12、24 h按2.1.3色谱条件进样，计算得到绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的RSD值分别为1.14%、1.52%、1.67%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 取同一批怀菊花样品(Y14)，按2.1.2项下条件平行制备6份供试品溶液，按照2.1.3条件测定，计算得到绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的RSD值分别为1.66%、1.28%、1.97%，表明方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 取已知含量的怀菊花粉末(Y14)6份，精密称定，分别加入一定量的绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品溶液，2.1.2方法制备成供试品溶液，结果见表2。

注：A.绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸混和对照品；B.大白菊样品；C.小白菊样品；D.小黄菊样品；E.珍珠菊样品；1.绿原酸；2.木犀草苷；3.3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸。图1 怀菊花样品HPLC图

表2 绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸加样回收率(n=6)

2.1.9 样品含量测定 取32批怀菊花样品溶液按2.1.2项下条件进行分析，测得绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量，见表3。其中，小白菊与小黄菊符合《中华人民共和国药典》2015版要求，大白菊的木犀草苷含量较低，不符合要求。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品适量，用70%乙醇水定容至50 mL，摇匀，配制成质量浓度为0.3 mg·mL-1的溶液，4 ℃保存，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取样品粉末(过四号筛)1 g，置于150 mL具塞锥形瓶中，加70%乙醇水30 mL，超声提取30 min，用70%乙醇水定容至100 mL容量瓶中，过滤，即得。

2.2.3 波长的选择 吸取芦丁对照品溶液3 mL于10 mL容量瓶中，用30%乙醇水定容，取2 mL于另一10 mL的容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min；加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min；再加入4%氢氧化钠溶液4 mL，并用30%乙醇水定容，静置20 min后，于波长200～800 nm测定吸收光谱，并确定芦丁对照品的最大吸收波长为511 nm。

2.2.4 标准曲线的绘制 配制质量浓度分别为0.052、0.100、0.153、0.204、0.253 mg·mL-1芦丁对照品溶液，分别取3 mL于10 mL容量瓶中，用30%乙醇水稀释定容，再从中吸取2 mL于另一10 mL的容量瓶中，依次加以上3种显色剂并定容，摇匀。静置20 min，于511 nm处测其吸光度A值。按浓度与吸光值相关关系求出回归方程：Y=2.813 6X+0.072(r=0.999 0)，芦丁在0.050～0.25 mg·mL-1线性关系良好。

2.2.5 样品测定 将供试品溶液用30%乙醇水定容至10 mL，吸取2 mL，依次加入3种显色剂，静置20 min，于511 nm处测定吸光度值，总黄酮含量测定结果见表3。

2.3 挥发油含量测定

参照《中华人民共和国药典》2015年版四部(通则2204)挥发油测定法甲法提取挥发油。称取怀菊花样品50.00 g，研磨粉碎，置于2000 mL圆底烧瓶中，加入蒸馏水700 mL和沸石数粒，待挥发油量不再增加，读取刻度，计算挥发油含量，结果见表3。

表3 32批怀菊花样品不同成分的含量测定结果 %

2.4 不同商品规格怀菊花化学成分的系统聚类分析

对32批怀菊花5个化学成分含量进行标准化处理，利用SPSS20.0分析软件，采用Ward法进行聚类分析，聚类树状图见图2。

图2 怀菊花样品化学成分含量聚类图

树状图显示，32批怀菊花样品中，大白菊、小白菊可各聚为一类，小黄菊和珍珠菊可聚为一大类。

2.5 怀菊花化学成分的SPSS方差分析

本研究运用SPSS20.0分析软件对怀菊花4个商品规格的5个化学成分进行方差分析，并采用字母标记法进行显著性分析，结果见表4。

从绿原酸含量分析，大白菊>小白菊>小黄菊>珍珠菊，且珍珠菊与其他3个规格具极显著性差异，且含量不符合2015版《中华人民共和国药典》要求；从木犀草苷含量分析，珍珠菊>小白菊>小黄菊>大白菊，大白菊与小白菊和珍珠菊具有极显著性差异，但大白菊含量不符合2015版《中华人民共和国药典》要求；从3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量分析，大白菊>小白菊>小黄菊>珍珠菊，除大白菊与小白菊无显著性差异外，其他各规格间均具有极显著性差异，珍珠菊含量不符合2015版《中华人民共和国药典》要求；从总黄酮含量分析，大白菊与小黄菊、小白菊与小黄菊间具有显著性差异，其他规格无显著性差异；从挥发油含量分析，大白菊分别与小白菊和小黄菊具有极显著性差异，小白菊与小黄菊具有极显著性差异。

表4 不同商品规格怀菊花方差分析多重比较结果 %

注：含有相同字母间差异无统计学意义，含有不同字母间差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

怀菊花主产于河南焦作地区，《中华人民共和国药典》2015版将其收录于菊花项下，而怀菊花在市场上流通的商品规格有大白菊、小白菊、小黄菊和珍珠菊4种，且均为栽培品种[8]。由于怀菊花栽培品种和采收加工方式的不同，导致其形态特征和质量发生了较大的变化[9，12]。鉴于以上问题，本研究参考2015版《中华人民共和国药典》菊花项下的含量测定项，以绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、总黄酮和挥发油为指标，对不同商品规格的怀菊花进行了测定，在32批怀菊花样品中，小白菊和小黄菊均符合2015版《中华人民共和国药典》标准，8批大白菊的木犀草苷含量不符合2015版《中华人民共和国药典》规定。大白菊是怀菊花的传统栽培品种，舌状花较少，管状花多，在市场流通过程中花瓣容易散落，导致其品相不佳，再加上目前大白菊的产量也很小，因此其是否被淘汰需要进一步进行研究。珍珠菊的绿原酸及3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量明显较其他3种规格低，均不符合2015版《中华人民共和国药典》要求。在调查中发现，珍珠菊主要以茶饮的形式在市场上流通，为未开放的花蕾，性状与2015版《中华人民共和国药典》的描述也不相符，因此不是怀菊花的药用品种。

以5个化学成分的含量为指标，对怀菊花的5种商品规格进行聚类分析，结果表明，大白菊和小白菊可各自聚为一类，小黄菊与珍珠菊聚为一类，这与它们的亲缘关系相一致，珍珠菊也属于黄色菊花类，虽然小黄菊符合2015版《中华人民共和国药典》要求，为药用菊花的一个规格，但是在产地更习惯用于茶饮。对不同商品规格怀菊花进行方差分析发现，各个规格之间存在显著性的差异，说明在同一个生长地区，不同品种之间存在着差异。2015版《中华人民共和国药典》含量测定项下，小白菊成分含量较小黄菊高，在化学成分含量上优于小黄菊，这与文献[13]报道一致。