四妙勇安汤活性部位配伍方薄层色谱鉴别及绿原酸和哈巴俄苷的含量测定△

杨会，宋珂，李慧，白云绮，王淑琪，吴圣贤，陈立新，聂波*

1.北京中医药大学 中药学院，北京 100029；2.北京中医药大学东直门医院/中医内科学教育部重点实验室和北京市重点实验室，北京 100700

四妙勇安汤由金银花、玄参、当归、甘草四味药组成，最早见于华佗《神医秘传》，后收载于《验方新编》，具有清热解毒、活血通脉之功[1-4]。课题组前期实验发现，四妙勇安汤可以通过抑制炎症反应，减轻动脉粥样硬化进展[5-7]。根据四妙勇安汤处方所含化学成分的理化性质，课题组采用不同浓度乙醇提取，大孔吸收树脂分离纯化，结合细胞药效学筛选，得到CS03、CS04、CS05 3个活性部位，通过体外药效学和动物实验筛选，确定CS03∶CS04∶CS05=345∶270∶258为最佳活性配比，组成该配伍方，已获得专利授权[8]。

中药成分的定性鉴别与定量测定是保证其安全、有效、质量可控的基础和前提[9]，是现代化中药产业的重点内容。目前还没有该配伍方定性鉴别和含量测定的相关研究，薄层色谱法因能够同时对多个样品进行分离、样品预处理简单、经济高效、简便直观的优势在中药的分析及鉴别中被广泛应用；HPLC由于分离效率高、选择性好、检测灵敏度高、操作自动化、应用范围广等特点，目前广泛应用于中成药质量控制[10-11]，为了更好地控制该配伍方的质量，本实验采用薄层色谱建立了该配伍方中玄参、甘草的定性鉴别方法，并采用HPLC技术，以绿原酸和哈巴俄苷为检测指标建立了配伍方中金银花、玄参两味药材的的含量测定方法，为该配伍方的新药研发提供简单、快速、有效的质量控制方法。

1 材料

1.1 仪器

高效液相系统为Agilent1100 HPLC系统，包含DAD检测器、二元泵、在线脱气机、自动进样器；AEG-40SM型电子天平(日本岛津公司)；SSW-420-2S型电热恒温水槽(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；ZF-20D暗箱式紫外分析仪(上海宝山顾村电光仪器厂)；202-2AB型电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；双槽玻璃层析缸(规格：10 cm×10 cm)；玻璃点样毛细管(华西医科大学仪器厂，内径为0.5 mm，管长为100 mm，硬质中性玻璃)；显色喷雾瓶(华西医科大学仪器厂)；硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂分厂，规格为10 cm×20 cm，厚度为0.20～0.25 mm)。

1.2 试药

对照药材金银花、玄参、甘草(中国食品药品检定研究院，供薄层色谱用，批号分别为：121060-200906、121008-200906、120904-200512)；乙腈为色谱纯(德国Merck公司)；对照品绿原酸、哈巴俄苷(中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号分别为110753-200413、111730-200605)；Milli-Q超纯水；其他试剂均为分析纯(北京化学试剂厂)。

2 方法与结果

2.1 玄参薄层色谱鉴别

取配伍方4 mg，加甲醇5 mL，振摇，使溶解，作为供试品溶液。另取玄参对照药材粉末1 g，加甲醇10 mL，浸泡1 h，超声处理30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加25 mL水溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇，蒸干，残渣加2 mL甲醇溶解，作为对照药材溶液。哈巴俄苷配制成质量浓度为0.5 mg·mL-1的溶液。制备不含玄参的样品，按前法同样操作，作为阴性对照样品溶液。鉴别方法参考2015版《中华人民共和国药典》[12]。为保证实验结果的准确性和重复性，样品两次重复点样，供试品色谱中，与对照品、对照药材相应的位置上，供试品溶液显相同的斑点，见图1。

注：1.玄参对照药材；2.哈巴俄苷；3.样品；4.样品；5.阴性。图1 玄参薄层鉴别色谱图

2.2 甘草薄层鉴别

取甘草酸铵对照品加甲醇制成质量浓度为2 mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。参考2015版《中华人民共和国药典》[13]制备甘草对照药材溶液、样品溶液和阴性对照样品溶液并进行鉴别。为保证实验结果的准确性和重复性，样品两次重复点样，供试品色谱中，在与对照品、对照药材相应的位置上，显相同的斑点，见图2。

注：1.甘草对照药材；2.甘草酸铵；3.样品；4.样品；5.阴性。图2 甘草薄层鉴别色谱图

2.3 绿原酸、哈巴俄苷含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：ZorbaxSB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈，梯度洗脱(0～15 min，5%～10%B；5～15 min，10%～14%B；15～18 min，14%～17%B；18～25 min，17%～81%B；25～40 min，81%～65%B；70～80 min，65%～20%B)；流速：1.0 mL·min-1；DAD检测器；检测波长：365 nm；柱温：30 ℃；进样量5 μL。

2.3.2 样品制备 对照品溶液制备：精密称取绿原酸、哈巴俄苷对照品，加甲醇制成每mL含绿原酸、哈巴俄苷分别为0.2、0.02 mg的溶液，即得。

供试品溶液制备：取配伍方100 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，超声30 min，补足减失质量，摇匀，过微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.3.3 方法学考察

2.3.3.1 系统适应性与专属性 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1%甲酸水(32∶68)为流动相；柱温：30 ℃。理论塔板数按绿原酸、哈巴俄苷峰计算应不低于1000、5000。取供试品溶液连续进6针，进样后HPLC图，对照品和供试品中绿原酸、哈巴俄苷的保留时间一致，见图3。

2.3.3.2 线性关系 精密称取干燥的绿原酸、哈巴俄苷对照品，加甲醇分别制成质量浓度为0.195、0.019 2 mg·mL-1的溶液，分别进样1、2、4、6、8 μL和1、2、5、10、20 μL，按上述色谱条件测定峰面积。以绿原酸、哈巴俄苷对照品进样量(μg)对数

注：A.对照品绿原酸；B.对照品哈巴俄苷；C.供试品。图3 四妙勇安汤活性配伍方专属性考察图谱

值为横坐标，峰面积对数值为纵坐标绘制标准曲线，其回归方程分别为Y=0.000 8X+0.002 2，r=0.999 9；Y=0.000 4X+0.000 3，r=1.000 0，绿原酸和哈巴俄苷分别在0.195～1.560、0.019 2～0.384 0 μg·μL-1线性关系良好。

2.3.3.3 供试品溶液制备 取配伍方40 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加50%的乙腈定容，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.3.3.4 精密度试验 分别取质量浓度为39.0 μg·μL-1的绿原酸对照品溶液和质量浓度为19.2 μg·mL-1的哈巴俄苷对照品溶液重复进样6次，峰面积RSD分别为0.2%、0.2%。

2.3.3.5 重复性试验 取同一批号的配伍方，精密称取40 mg，共6份，依法提取测定，供试品绿原酸及哈巴俄苷含量RSD分别为0.60%、0.25%。

2.3.3.6 稳定性试验 取供试品溶液分别在0、3、6、12、24 h进样测定，绿原酸峰面积分别为1 233.6、1 231.6、1 235.3、1 225.8、1 240.7、1 233.4，RSD为0.4%，哈巴俄苷峰面积分别为128.5、129.2、129.1、124.4、125.8，RSD=1.5%，结果表明供试品溶液中绿原酸、哈巴俄苷24 h内基本稳定。

2.3.3.7 回收率试验 精密称取配伍方20、100 mg(其中绿原酸及哈巴俄苷质量分数分别为5.3%、0.25%)，各9份，置于10 mL容量瓶中，分别精密加含有绿原酸0.90、1.13、1.37 mg的对照品溶液，含有哈巴俄苷0.20、0.25、0.30 mg的对照品溶液，加50%乙腈定容，定容后摇匀，依法提取测定，结果见表1。

表1 绿原酸和哈巴俄苷加样回收率试验结果(n=9)

2.3.4 配伍方中绿原酸、哈巴俄苷的含量测定 取配伍方40 mg，精密称定，依法提取制成供试品溶液，进样二次测定，以外标两点法对数方程计算，即得，结果见表2。

表2 配伍方中绿原酸、哈巴俄苷含量测定

3 讨论

3.1 定量药效成分的确定

已有数据表明，四妙勇安汤水煎液主要含有环烯醚萜类、黄酮类、苯丙素类、有机酸类等多种成分[14-15]。在该配伍方中，金银花和玄参为君药，金银花主要含有奎宁酸类和黄酮类成分，玄参中主要成分为环烯醚萜类成分，《中华人民共和国药典》2015版规定，金银花药材中主要检测绿原酸和木犀草苷两个成分；玄参药材中主要检测哈巴苷和哈巴俄苷两个成分，因配伍方是采用提取并经大孔树脂富集获得洗脱部位，经活性筛选配伍而获得，前期质谱鉴定中发现木犀草苷含量较低，哈巴苷未能检测到，不作为该配伍方的含量测定的指标性成分，因此选择绿原酸和哈巴俄苷作为配伍方的含量测定成分。文献报道，绿原酸和哈巴俄苷均可通过激活PPAR-γ受体，对动脉粥样硬化炎症反应具有较好的抑制作用，从而发挥抗动脉粥样硬化的活性，因此选择绿原酸和哈巴俄苷作为配伍方的药效成分进行含量测定[16-18]。

3.2 样品处理、色谱条件的优化

在本实验中供试品溶液制备方法，参照《中华人民共和国药典》金银花、玄参含量测定供试品溶液制备方法设计，考虑到本品为55%乙醇提取后大孔树脂富集得到的配伍方，结合流动相采用的乙腈-甲酸水系统洗脱，所以笔者选择用50%的乙腈水溶液来溶解样品，溶解效果很好。对本品的含量测定，笔者采用乙腈和0.1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱，考察了色谱条件，结果配伍方中绿原酸、哈巴俄苷分离度好，灵敏度高，方法合理可靠。

“鉴别”是鉴定中药真假的检测项目，“含量测定”是对中药材中主要药效成分或指标性成分的定量控制，是保障中药材有效性的最重要的指标，也是评价中药材质量优劣的重要指标。本研究基于药效导向筛选四妙勇安汤活性部位，根据体外药效和动物实验确定疗效最佳的配伍方，首次同时对该配伍方中玄参和甘草的化学成分进行薄层鉴别，采用HPLC的方法对配伍方中绿原酸和哈巴俄苷进行含量测定，为其配伍方的质量评价研究提供参考。

4 结论

本实验所建立的四妙勇安汤活性部位配伍方以哈巴俄苷和甘草酸铵为指标的薄层色谱鉴别方法专属性强，准确度高，以绿原酸和哈巴俄苷为指标的HPLC含量测定方法具有较好的精密度、重复性和稳定性，操作简便，标准可行，为有效控制该配伍方的质量提供准确、可靠的检测方法，也为配伍方作为新药的质量标准制定提供参考。