邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二辛酯对大黄鱼受精卵及仔鱼的急性毒性效应

李 磊，蒋 玫，王云龙

（中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090）

邻苯二甲酸酯（phthalic esters，PAEs）是一类重要的工业用有机化合物，作为工业生产中塑料、树脂、橡胶等的增塑剂可以增强产品的可塑性和韧性，同时也可以作为农药载体以及其它化工产品的生产原料［1］。我国每年的PAEs消耗量超过一百万吨［2］。PAEs具有很低的水溶性，但易溶于有机溶剂，对固体颗粒、生物体表现出很强的吸附性和亲和性，PAEs在塑料中以范德华力和氢键与其它材料相结合，结构松散，作用力小，可由塑料制品中扩散至外界环境，而广泛存在于大气、水体、土壤以及生物体中［3-4］。研究表明，在大气、水体、土壤等自然环境以及生物乃至人体中普遍发现PAEs的存在，在全球主要工业国家环境中PAEs均达到普遍检出的程度，其已成为一类全球性最普遍的有机污染物［5］。美国环境保护署（U．S Environmental Protection Agency，EPA）将其中的邻苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DMP）、邻苯二甲酸二乙酯 （diethyl phthalate，DEP）、邻苯二甲酸二丁酯 （dibutyl phthalate，DBP）、邻苯二甲酸二辛酯 （dinoctyl phthalate，DOP）、邻苯二甲酸丁苄酯（butyl benzyl phthalate，BBP）和邻苯二甲酸（2-乙基己基）酯（di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP）列为优先控制污染物［6］，我国也将其中的 DMP、DBP和 DEHP列为环境优先控制污染物［7］。众多研究均表明，DBP、DOP对水生生物具有一定的毒性，DBP能影响大型溞（Daphnia magna）的捕食行为与繁殖［8-10］；对斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）、短裸甲 藻 （Gymnodinium breve）、三 角 褐 指 藻（Phaeodactylum tricornutum）等微藻的生长均有抑制作用［11-12］；对斑马鱼 （Danio rerio）［13-14］、红鳍笛 鲷 （Lutjanus erythropterus）［15］、鲤 （Cyprinus carpio）［16］等鱼类均具有一定的毒性效应。DOP对鲤［17-18］等鱼类生理生态及遗传均有一定的影响。但目前还未见 DBP、DOP对大黄鱼（Larimichthys crocea）毒性效应影响的研究。

本研究选择中国东海重要的经济鱼类大黄鱼作为受试生物，开展DBP、DOP对大黄鱼早期发育阶段的急性毒性效应研究，旨在揭示邻苯二甲酸酯对水生生物的毒性效应和机制，为相关水质标准的制定提供科学依据。

1 材料与方法

1．1 实验材料

实验所用海水从自然海区抽取，盐度为21，pH为8．1，进行沉淀和砂滤，充分曝气（24 h以上）后备用，实验对象鱼卵来自江苏省海洋与水产研究所育苗场的大黄鱼亲鱼（体长约为45 cm）的自然排卵，初孵仔鱼由同一批受精卵孵化。

1．2 实验母液的制备

邻苯二甲酸二丁酯（DBP）（CAS：84-74-2）和邻苯二甲酸二辛酯（DOP）（CAS：117-81-7）均购于Sigma-Aldrich公司，用分析纯丙酮作为助溶剂（体积比＜0．1%）配置DBP、DOP储存液，储存液进一步稀释至指定暴露浓度。

1．3 实验方法

大黄鱼鱼卵96 h急性毒性实验：以1 L的低型烧杯为容器。在每个烧杯中投入约100个未孵化的受精卵（4细胞分裂期，卵径为0．9 mm）。控制实验温度为18℃左右，pH为8．1，并保持实验用水溶解氧为饱和溶氧的60%以上。采用静态法进行孵化实验。每间隔12 h在显微镜下观察并进行数据统计，每间隔24 h换100%同等浓度的溶液，记录实验期间胚胎出现的死亡率、孵化率、心率以及一些形态学上的畸形等。当用显微镜观察到任一组鱼卵破膜仔鱼时实验结束。根据预实验，DBP和DOP分别按等对数间隔设置5个浓度组（DBP：6．67、3．73、1．87、0．93、0．47 mg·L-1；DOP：26．67、13．33、6．67、3．33、1．67 mg·L-1），同时以自然海水为对照组，每个浓度组设3个平行样。

大黄鱼初孵仔鱼96 h急性毒性实验：在每个1 L烧杯中放入30尾仔鱼，每天换水1次，期间不投喂。分别于实验后24、48、72、96 h观察记录大黄鱼仔鱼中毒及死亡情况。DBP和DOP分别按等对数间隔设置 6个浓度组（DBP：8．00、6．67、4．00、3．73、2．67、1．87mg·L-1；DOP：26．67、13．33、6．67、3．33、1．67、0．83 mg·L-1），同时以自然海水为对照组，每个浓度组设3个平行样。

同时设置大黄鱼鱼卵、初孵仔鱼丙酮溶液试验组，结果表明丙酮添加对大黄鱼鱼卵的死亡率、孵化率无影响，对初孵仔鱼的死亡率无影响。

1．4 数据处理方法

利用SPSS16．0进行数据处理，采用概率单位算法，求得回归方程并进行可靠性检验，计算半致死浓度LC50及95%置信区间。根据公式SC＝96 h LC50×0．1，推算出安全浓度。

2 结果与分析

2．1 DBP和DOP对大黄鱼鱼卵的影响

图1 DBP和DOP对大黄鱼鱼卵孵化率的影响曲线Fig．1 Hatching rate of fish eggs of P．crocea in solutions with different DBP and DOP concentrations

不同暴露浓度下，DBP和DOP对大黄鱼鱼卵的孵化率有显著不同的影响（图1）。大黄鱼鱼卵的孵化率随DBP和DOP浓度上升而下降，均显示出负相关剂量效应关系。同一孵化率水平的情况下，DBP的浓度低于DOP。

不同暴露浓度下，DBP和DOP对大黄鱼鱼卵的死亡率也有显著不同的影响（图2）。大黄鱼鱼卵的死亡率均随DBP和DOP浓度上升而升高，显示出正相关的剂量效应关系。同一死亡率水平的情况下，DBP的浓度低于DOP。

2．2 DBP和DOP对大黄鱼初孵仔鱼的急性毒性及安全性评价

不同暴露浓度下，DBP和DOP对大黄鱼初孵仔鱼的96 h急性毒性致死率有显著不同的影响（图3）。随着DBP和DOP暴露浓度的升高，大黄鱼初孵仔鱼死亡率逐渐升高，二者剂量效应呈现正相关关系。

DBP和DOP对大黄鱼初孵仔鱼的96 h LC50存在差异（表 1），DOP的 96 h LC50（6．57 mg·L-1）高于 DBP（5．23 mg·L-1），且 DOP的安全浓度（0．66 mg·L-1）也高于 DBP（0．52 mg·L-1）。表明DBP对大黄鱼初孵仔鱼的致死毒性要高于DOP。

图2 DBP和DOP对大黄鱼鱼卵死亡率的影响Fig．2 Acute mortality rate of Pseudosciaena crocea fish eggs in solutions with different DBP and DOP concentrations

图3 DBP和DOP对大黄鱼初孵仔鱼的96 h急性致死率Fig．3 Acute mortality rate of P．crocea larvae in solutions with different DBP and DOP concentrations

表1 DBP和DOP对大黄鱼初孵仔鱼的半致死浓度Tab．1 96 h LC50 values of DBP and DOP to P．crocea

依据国家环保局的“水和废水监测分析方法（第四版）”［11］中的鱼类急性毒性分级标准（表2），可以看出DBP和DOP对大黄鱼初孵仔鱼的危害等级属于高毒毒性，且毒性DBP＞DOP。

2．3 DBP和DOP对大黄鱼鱼卵和初孵仔鱼的镜检结果

对暴露在DBP和DOP溶液里的大黄鱼鱼卵和初孵仔鱼进行显微镜镜检，可以发现，高浓度试验组鱼卵发育出现异常。与对照组相比（图4-a），原本光滑的鱼卵细胞表面出现了一些包状突起，卵膜损伤，胚体皱缩，尾部畸变，停止发育，甚至出现自溶现象（图4-b）。与对照组（图4-c）相比，处于出膜时期的大黄鱼鱼卵在高浓度DBP和DOP的暴露组出现畸形（图4-d），初孵仔鱼毒性表现为仔鱼卵黄囊水肿、脊椎畸形，尾椎弯曲。

3 讨论

实验结果表明，DBP和DOP对大黄鱼鱼卵和初孵仔鱼均具有一定的毒性效应，但两者的毒性效应存在差异。同一种邻苯二甲酸酯类化合物对不同鱼类的毒性相差也较大（表3）。本实验中DBP对大黄鱼仔鱼的96 h LC50为5．23 mg·L-1，低于虹鳟（Salmo gairdneri）的 6．47 mg·L-1［19］、红鳍笛鲷的 6．66 mg·L-1［15］、斑马鱼的 9．67 mg·L-1［15］，但高于斑点叉尾鮰的 2．91 mg·L-1［19］。本实验中 DOP对大黄鱼仔鱼的 96 h LC50为 6．57 mg·L-1，低于鲤的 7．95 mg·L-1［18］，也低于斑马鱼的 9．89 mg·L-1［20］。这种毒性的差异一方面与鱼类的种类、鱼类所处发育阶段有密切关系，比较文献［20］和［21］可以发现，DBP对斑马鱼胚胎阶段的96 h LC50高于斑马鱼幼体，说明了鱼类早期发育阶段对毒性物质的暴露更加敏感；另一方面，不同种类的邻苯二甲酸酯类化合物由于其自身结构的差异，对鱼类的毒性效应也有差异。STAPLES等［21］研究了不同邻苯二甲酸酯类化合物对大型溞的急性毒性，DMP毒性最小，其次是DEP和DBP，同时指出邻苯二甲酸酯类化合物侧链上的碳链越长，其毒性越大。何秀婷等［22］研究了 DMP、DEP、DBP和DEHP对斑马鱼胚胎发育的毒性效应，结果也显示了4种邻苯二甲酸酯类化合物的毒性各不相同（DBP＞DEHP＞DEP＞DMP），结论也是碳链越长，对斑马鱼胚胎的毒性越大。

表2 鱼类急性毒性分级标准［11］Tab．2 Fish acute virulence classification standard

图4 大黄鱼鱼卵和初孵仔鱼的镜检结果Fig．4 Microscopic examination results of fish eggs and first hatched larvae of P．crocea

表3 DBP和DOP对其鱼类的急性毒性Tab．3 Acute toxicities of DBP and DOP to some fishes

胚胎的孵化率对环境因子反应敏感，有重要的生物学意义，常作为一种毒理学研究的指标。DBP和DOP对大黄鱼鱼卵和初孵仔鱼的毒性效应差异也体现在对其的致畸效应上，依据本实验结果，低浓度DBP和DOP对大黄鱼鱼卵的孵化率影响不明显，但高浓度DBP和DOP对胚胎发育产生较严重的畸形效应，孵化率有所降低，甚至出现孵化仔鱼死亡的现象。这与DBP和DOP对大黄鱼鱼卵和初孵仔鱼的96 h LC50结果是一致的。其机理可能是赖胺酰氧化酶（LOX）的活性被抑制［24］，导致发生基因突变［25］。目前全球地表水中 PAEs一般为 μg·L-1级［26］，汇入海洋中可能会被进一步稀释，对海洋生物的急性毒性影响较小，但其对海洋生物的富集及慢性毒性效应需要进一步研究。