文蛤生物活性多肽／蛋白研究进展

陈 琛，蔺蓓蓓，徐尤美，李鑫鑫，刘 祥

（陕西理工大学中德天然产物研究所，陕西理工大学生物科学与工程学院，汉中 723000）

文蛤（Meretrix meretrix）属软体动物门，双壳纲，真瓣鳃目，帘蛤科，文蛤属［1］。在西太平洋（中国、朝鲜半岛、日本和东南亚）和印度洋（亚丁湾和阿曼湾）等海域广泛分布，常在河口及有淡水注入的内湾附近栖息。

文蛤肉质鲜美，营养成分丰富，含有18种氨基酸，其中含有人体所需的全部10种必需氨基酸，文蛤肉中总氨基酸含量为428～506 mg·g-1，必需氨基酸含量为168～188 mg·g-1，其中亮氨酸和赖氨酸含量较高，分别是31～37 mg·g-1和 35～36 mg·g-1，必需氨基酸（EAA）／总氨基酸（TAA）和EAA／非必需氨基酸（NEAA）的值分别为39%和64%，基本符合FAO／WHO优质蛋白质评价标准［2］。文蛤肉含有矿物质、维生素以及不饱和脂肪酸DHA和EPA［3］，DHA和EPA含量分别占总脂肪酸的 13．33% ～16．47%和4．75%～7．11%。文蛤不仅营养丰富，而且还有食疗和药用价值。文蛤作为中药资源被列入《本草纲目》、《伤寒杂病论》等中医典籍中［4］，具有平肝化痰、清肺、软坚散结、制酸止痛等功效，用于肺结核、阴虚盗汗、糖尿病以及肿瘤等疾病治疗，而且还有降糖、降血脂、抗突变、抗衰老、免疫调节等多种功效［5］。文蛤壳可用于治疗前列腺增生、湿疹、溃疡、鹅口疮、中耳炎、肺结核等疾病。

20世纪60年代有国外学者研究证实了文蛤提取物的抗肿瘤活性，并将研究结果发表在《Science》杂志［6］；90年代末国内学者开展了文蛤抗肿瘤活性物质的研究。进入21世纪以后，从海洋生物中寻找新的活性物质受到了很大的重视，加之现代生物技术兴起与分离纯化技术的成熟应用等，使得文蛤活性成分的研究持续开展，通过大量的研究与药理学实验证明了文蛤活性物质的药理作用、生物功能和营养价值。目前已经分离纯化、鉴定了以下文蛤活性成分：1）文蛤活性肽（抗肿瘤肽、抗氧化肽、抗菌肽、降压肽、寡肽）；2）文蛤活性蛋白（凝集素、铁蛋白、金属硫蛋白、热休克蛋白、腺苷二磷酸核糖基化蛋白、抗补体蛋白、肿瘤坏死因子、凝血蛋白、葡聚糖结合蛋白）；3）文蛤酶及酶制剂（溶菌酶、乳酸脱氢酶、组织蛋白酶、谷胱甘肽过氧化物酶、N-羟甲基-L-丙氨酸脱氢酶、抗氧化酶、腺苷脱氨酶、碱性磷酸酶、磷酸水解酶）；4）酸类（丁醛、乙酸、肉豆蔻酸、十六烯酸、棕榈酸）；5）多糖；6）甾醇；7）油脂；8）其它成分，如类胡萝卜素。本文重点阐述文蛤生物活性肽和蛋白的研究进展，以期为文蛤活性物质的研究开发提供参考。

1 文蛤活性蛋白／多肽研究

目前已从文蛤肉中鉴定了20多种具有各种生物活性或功能的多肽或蛋白，详见表2。

1．1 抗肿瘤肽／蛋白

文蛤抗肿瘤肽／蛋白是研究最早、取得成果最多的文蛤活性成分之一，目前已经从文蛤中鉴定了多种抗肿瘤肽／蛋白，详见表3。SCHMEER［21］的研究揭示文蛤中含有肿瘤抑制因子，经提取得到的肿瘤抑制因子对小鼠S180肉瘤有显著的抑制作用，对正常小鼠则无毒性，并将这一活性物质命名为“蛤素”（mercenene）。对蛤素成分的研究表明，它是一类相对分子质量小于10 kDa的多肽类物质。

在我国，文蛤抗肿瘤活性多肽方面的研究也取得了很多成果。利用凝胶色谱和高效液相色谱法纯化得到文蛤抗肿瘤肽，基质辅助的激光解析质谱测得其分子为3．147 kDa，该肽能够抑制人胃腺癌细胞的增殖并破坏人胃腺癌细胞的结构骨架，当多肽的浓度达到4．0μg·mL-1时，对癌细胞的抑制率为 60%［22］。NING等［23］从文蛤体腔液体中利用硫酸铵沉淀、离子交换色谱和疏水色谱分离纯化得到文蛤抗肿瘤肽MML，分子量约为40 kDa，对人肝癌细胞BEL-7402、人乳腺癌细胞MCF-7、人结肠癌细胞HCT116等均有抑制作用。WANG等［24］从文蛤中纯化得到15 kDa的多肽Mere15，对人白血病细胞K562和人肺癌细胞A549有抑制作用，其半数抑制浓度（IC50）均为38．2μg·mL-1，机理是通过线粒体途径引起细胞凋亡。为了解决由恶性肿瘤细胞所造成的难以治愈的癌症，迫切需要寻找抗肿瘤天然活性物质，文蛤中的抗肿瘤肽／蛋白可为此提供宝贵资源。采用分离纯化技术鉴定得到了10多种文蛤抗肿瘤蛋白，进行抗肿瘤活性测定，表明其具有很好的抗肿瘤活性，但目前文蛤抗肿瘤药物的开发和市场化相对滞后。

表1 文蛤肉营养成分及含量Tab．1 General nutritive composition in muscles of M．meretrix （%）

表2 文蛤生物活性肽（蛋白）及特性Tab．2 Bioactive peptides（proteins）and their characteristics in M．meretrix

表3 文蛤抗肿瘤肽（蛋白）及特性Tab．3 Antitumor peptides（proteins）and their characteristics in M．meretrix

1．2 抗菌肽

抗生素残留及耐药性迫使人类不断寻找开发新型、天然、耐药性低的抗生素替代品，抗菌肽是一类具有抗菌活性的小分子活性肽，SUGESH等［30］将文蛤肉进行匀浆后，用有机溶剂进行提取，提取物对10株病原性细菌和6株病原性真菌具有较好的抑菌活性，其中对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌抑菌活性最好。SATHYAN等［8］从文蛤中通过分子克隆得到Histone-H2A来源的抗菌肽Molluskin，由25个氨基酸组成，分子量为 2．840 kDa，与皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）抗菌肽Abhisin同源性较高。抗菌肽较传统抗生素有很多优点，包括分子量小、热稳定、水溶性好、强碱性、广谱抗菌和作用机制独特等特点，在医药卫生、畜牧业、食品防腐剂等方面有广阔的应用前景。

1．3 降血压肽

血管紧张素转换酶（ACE）在血压调控中起到了非常关键的作用，通过催化血管紧张素转移酶I的C端使其裂解为具有活性的血管紧张素转移酶II，后者诱导醛固酮的释放引起钠离子内流，使血压升高。从文蛤肉水解物和酶解物中可分离提取ACE抑制剂。提取方法是：超滤、凝胶过滤色谱Sephadex G-25、RP-HPLC等纯化程序得到2个纯品肽E1和E2，其中E2仅为2个氨基酸（Tyr-Asn）组成，IC50为 0．015 mg·mL-1。通过体外模拟试验证实可以抗消化酶降解，具有较好的生物利用度［20］。目前，高血压患者主要以口服化学合成类的降压药物为主，但是服药后会出现不同程度、不同症状的副作用，如低血压、心动过缓、呕吐等。而文蛤来源的生物活性肽的降血压效果虽然没有合成的药物好，但却具有绿色、天然、安全、健康、低成本等优点；其次，文蛤来源的生物活性肽既可以起到降血压的作用，同时本身也具有很高的营养价值，能为人们提供多种人体必需氨基酸［31］，所以有很好的开发前景。目前，文蛤降血压肽只得到了一种，文蛤中是否还存在其它的活性更高的降血压肽有待于进一步研究。

1．4 抗氧化肽

文蛤体内存在抗氧化作用的活性肽，其分子量小、机体易吸收、活性强，而且能有效地清除机体体内过多的活性氧自由基，保护细胞和线粒体的正常结构和功能，防止脂质过氧化的发生，在医药、化妆品、保健品等领域可以广泛应用［32］。有研究采用匀浆、硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤色谱Sephadex G-150柱层析从文蛤肉中分离得到3个蛋白峰，均有一定的抗氧化活性。用胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶水解文蛤3种不同部位的肉（软体部、足、内脏团），比较水解产物的抗氧化活性，然后采用FPLC、离子交换色谱和凝胶过滤色谱分离纯化了文蛤抗氧化肽，抗氧化肽对DPPH的清除率为 19．1% ～82．5%［33］。多个研究团队均开展了文蛤抗氧化肽研究，表4列出了采用单一酶、复合—双酶水解、复合—三种酶水解的制备文蛤抗氧化肽的方法和条件。

1．5 凝集素

凝集素是一类广泛分布于动物、植物和微生物中的非免疫来源的糖结合蛋白。文蛤凝集素（Meretrix meretrix lectin，MML）是一种唾液酸专一性结合的凝集素，是Ca2+依赖型凝集素。MML对40℃以上的温度敏感，其活性在pH 5．0～8．5比较稳定，等电点（pI）为5．6。MML分子是由2条肽链组成，这两条肽链分子量分别为29 kDa和30 kDa，肽链间经二硫键形成约为59 kDa的大亚基，再由约18个这种大亚基聚合成1 060 kDa的大分子。氨基酸组成及共价结合糖含量测定表明，MML分子是一种含5%的糖类的糖蛋白。李猛等［36］从文蛤中克隆了 C-型凝集素的基因（Mm-CTL）cDNA序列，全长为1 855 bp，其开放阅读框为519 bp，编码172个氨基酸。张晶晶等［10］克隆了文蛤C型凝集素1基因（Mm-Lec1）的全长cDNA序列。凝集素结构的多样性决定了凝集素具有多种功能，为海洋贝类先天免疫的“特异性”研究提供了基础。

1．6 铁硫蛋白和金属硫蛋白

铁硫蛋白在动植物组织中广泛存在，由24条多肽链（亚基）形成一中空的球形壳，其中央孔穴可容纳4 500个铁原子，铁为可溶、可使用形式，主要与羟基和磷酸基团结合，在机体代谢中起着非常重要的作用。文蛤铁蛋白亚基（MmeFer）在文蛤贝壳形成中可能起到了关键作用［37］。

金属蛋白质为低分子量、高巯基含量，能大量结合重金属离子，因此称为金属硫蛋白（MT），它能被金属离子、氧化损伤以及外界免疫刺激等多种因素诱导，参与生物体内金属水平的稳态调节、自由基清除、重金属解毒等生物学功能，已被联合国环境规划署遴选为海洋环境监测的生物标志物之一。蒋国萍等［11］采用RACE技术从斧文蛤（Meretrix lamarckii）中获得了金属硫蛋白（Mm-MT）的全长 cDNA序列，序列全长636 bp，开放阅读框长度为231 bp，编码76个氨基酸，编码的氨基酸中半胱氨酸含量丰富，占27%，预测分子量约为7．704 kDa，pI 7．138，序列特征分析表明，含有16个MT所特有的Cys-Xn-Cys结构，具有金属硫蛋白的典型特征。根据金属硫蛋白的特性，其可代替化学品用于化妆品、保健品和金属检测等行业［38］。

表4 文蛤抗氧化肽及特性Tab．4 Antioxidant peptides and their characteristics in Meretrix meretrix

1．7 凝血蛋白

CHENG等［13］研究发现了文蛤凝血蛋白（hemagglutinating proteins，HAP），收集文蛤血浆，透析，通过蛋白纯化色谱仪（Sephacryl S-300柱）纯化得到HAP，分子量为358 kDa，其由2个亚基组成。HAP对人、犬、莫桑比克罗非鱼（Oreochromis mossambicus）血液具有较好的凝集活性，在 pH 7．0、温度 4～10℃、盐度低于0．5%时，对莫桑比克罗非鱼血液凝集滴度达到210。文蛤凝血蛋白的鉴定和活性研究为未来开发制备天然凝血生物制品提供了选择。

1．8 抗血管生成蛋白

血管生成抑制蛋白可以多种因子为靶标抑制血管的形成。在恶性肿瘤靶向治疗中可以抑制肿瘤细胞血管的生成，也可应用于动脉粥样硬化疾病的治疗。GUPTA等［39］研究了文蛤甲醇提取物对血管生成的抑制作用，提取物浓度200μg·mL-1时，能显著抑制血管内皮生长因子（VEGF）诱导的新血管的增殖，抑制率为64．63%。

1．9 免疫调节蛋白

CHEN等［40］从文蛤中克隆了编码富含半胱氨酸的文蛤多肽（McCRIP）的cDNA序列，为一个Zn2+结合蛋白，包含高度保守的锌指结构。McCRIP的全长cDNA由237 bp的开放阅读框组成，编码78个氨基酸，预测分子量为8 635．8 Da，pI为 9．01。采用双链 RNA干扰方法研究McCRIP的功能，结果表明McCRIP基因失活后可以阻断文蛤发育，并造成大量死亡，推测McCRIP在文蛤早期发育和先天免疫中起到一定作用。就目前的研究而言，文蛤中免疫调节蛋白的免疫调节活性作用机理非常复杂，还需要进一步深入研究。

1．10 热休克蛋白

热休克蛋白（heat shock protein，HSP）是在从细菌到哺乳动物中广泛存在的一类热应激蛋白质。当有机体暴露于高温的时候，就会由热激发合成此种蛋白，来保护有机体自身。文蛤热休克蛋白（MmeHsc71）分子量为 71．43 kDa，cDNA全长2 292 bp，其中包括编码652个氨基酸的长为1 959 bp的开放阅读框。生物信息学分析确定其属于HSP 70家族的一个成员。实时定量PCR在空间和时间上比较健康文蛤和经溶血弧菌诱导的文蛤的表达模式：在空间上，在试验组织包括足、肝胰脏、外壳膜、鳃中都存在MmeHsc71 mRNA，但在经溶血弧菌感染24 h诱导的文蛤肝胰脏和鳃中MmeHsc71 mRNA明显增多；在时间上，分别经溶血弧菌感染诱导6、12、24 h的文蛤肝胰脏与健康文蛤肝胰脏的MmeHsc71 mRNA水平表达量相比明显增高，且与诱导时间呈正相关。定量免疫荧光实验结果也表明经副溶血弧菌感染24 h后的文蛤肝胰脏较正常文蛤肝胰脏MmeHsc71 mRNA表达量明显增加。推断MmeHsc71在介导文蛤抗菌免疫系统中具有重要作用。HSP 70作为“分子伴侣”在蛋白质的折叠、组装、转运、降解及调控中发挥重要作用，而且它在细胞周期调控、抗凋亡、抗氧化、免疫治疗等方面也具有重要功能，在生物工程和医学等方面的应用前景十分广阔。

1．11 腺苷二磷酸核糖基化蛋白

NAKANO等［16］从文蛤中发现了腺苷二磷酸核糖基化蛋白（ADP-ribosylating protein），命名为CARP-1，通过硫酸铵沉淀、离子交换CM52、超滤、凝胶过滤色谱和FPLC等步骤纯化了CARP-1，利用质谱鉴定分子量为20．332 kDa，并克隆了其cDNA。

除以上文蛤活性多肽（蛋白）以外，近年来还有学者克隆了文蛤宿主免疫防御素基因、文蛤抗补体蛋白、生长因子受体结合蛋白基因（GRB2）［41］、B型清道夫受体蛋白基因 （Mm-SRBI）［42］、文蛤 Smad家族蛋白基因（Mm-Smad1／5）［43］等。

2 文蛤蛋白酶及抑制剂

2．1 溶菌酶和抑制剂

溶菌酶是一种能破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键的碱性水解酶。文蛤1型溶菌酶基因（MmeLys）cDNA全长为552 bp，其中包含一个441 bp的开放阅读框，编码146个氨基酸的多肽，该多肽由15个氨基酸的信号肽和131个氨基酸的成熟肽组成，分子量为 14 601．44 Da［44］。克隆推导的溶菌酶氨基酸与菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）溶菌酶具有64%的同源性，且重组表达的MmeLys对G-和G+菌表现出较强的抑菌活性。通过 RT-PCR和 western blotting证明MmeLys mRNA主要在肝胰脏和鳃内表达。KUWANO等［45］通过乙酸提取、硫酸铵沉淀、阳离子交换色谱、RP-HPLC分离纯化得到了文蛤溶菌酶并结晶，对文蛤溶菌酶的理化性质进行研究，并对文蛤溶菌酶三维结构进行了解析（图1-A），并和蛋清溶菌酶、菲律宾蛤仔溶菌酶结构进行比较，发现Glu18比较保守，在3种溶菌酶中均存在，可为水解反应提供质子。文蛤溶菌酶结构解析两年后，LEYSEN等［46］报道文蛤溶菌酶抑制剂并解析其三维结构（图1-B），该抑制剂能与文蛤Ⅰ型溶菌酶结合形成复合物，抑制剂由3个暴露的PLII环形成的明显的“脊”插入到溶菌酶的底物结合槽中，导致形成稳定的“锁钥”模型，这为其它有应用或治疗前景的酶抑制剂的作用机理研究奠定了基础。

2．2 超氧化物歧化酶

文蛤 Cu／Zn超氧化物歧化酶（Cu／Zn SOD）基因全长cDNA 1 383 bp，具有462 bp的开放阅读框架，编码153个氨基酸，其在文蛤肝胰腺中表达量最高，血液细胞表达量最低［48］。采用原核表达方式在E．coli中表达了文蛤Cu／Zn超氧化物歧化酶，表达产物进行纯化得到21 kDa蛋白，酶比活力为27．12 U·mg-1。研究表明文蛤Cu／Zn SOD能有效消除活性氧（ROS），维持免疫系统的氧化还原平衡，有利于文蛤免疫系统抵御病原微生物的感染［49］。

2．3 组织蛋白酶

机体内的组织蛋白酶B（cathepsin B）参与溶酶体的蛋白质水解作用，与人类免疫、癌症、Ⅱ型糖尿病、肾脏疾病等有关［50］。文蛤组织蛋白酶B（MmeCB）的 cDNA全长1 647 bp，开放阅读框1 014 bp，编码337个氨基酸，MmeCB分子量约为37．3 kDa，pI 5．50，具有 3个保守氨基酸残基（Cys-111、His-282和 Asn-302），序列与哺乳动物组织蛋白酶B有55%的同源性。文蛤Cathepsin B基因在大肠杆菌中表达，纯化后获得重组的文蛤组织蛋白酶B（rMmeCB），酶学性质研究结果为 rMmeCB的 Km、Vmax和 Kcat分别是6．11μM、0．017 4μM·min-1和 277．57·s-1。

2．4 谷胱甘肽过氧化物酶

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，也是催化谷胱甘肽转变为氧化型的一种金属酶，通过减少脂质过氧化物和自由过氧化氢来保护生物体免受氧化损伤［51］。文蛤谷胱甘肽过氧化物酶（MmeGPx）基因包含723 bp和238 bp的2个内含子，开发阅读框711 bp，编码237个氨基酸的蛋白，序列分析MmeGPx与人的GPx 3高度相似。

图1 文蛤溶菌酶及抑制剂结构图Fig．1 Structure of lysozyme and inhibitor from M．meretrix

2．5 N-羟甲基-L-丙氨酸脱氢酶

LEE等［52］从文蛤中分离纯化了N-羟甲基-L-丙氨酸脱氢酶（strombine dehydrogenase，SDH），具体方法是采用硫酸铵沉淀、Sephacryl S-100凝胶过滤色谱、羟基磷灰石色谱、离子交换色谱DEAE-Sepharose和亲和色谱等多个色谱程序，最终纯化了文蛤SDH并研究了酶学特性，该酶分子量为46 kDa，纯度提高了470倍，最适pH 7．4～7．6，最适作用温度45～46°C。

除以上分离纯化或克隆鉴定的5种主要的文蛤酶以外，还有学者经过测定发现在文蛤组织中还含有乳酸脱氢酶、抗氧化酶等，但是尚未分离纯化得到纯酶，也未克隆得到其全序列。近年来有学者克隆了文蛤组蛋白去乙酰化酶1基因（HDAC1）、磺基转移酶基因（SULT）、果糖-1，6-二磷酸醛缩酶 9（FBA）基因［53］等。

3 文蛤生物活性多肽（蛋白）制备方法

文蛤活性多肽（蛋白）通过以下3种方法得到：1）提取分离纯化，主要采用硫酸铵沉淀，离子交换色谱、凝胶过滤色谱和HPLC，对精制得到的文蛤多肽（蛋白）进行活性和功能评价；该步骤为传统方法，方法稳定，结果可靠，预期可控制，但过程繁琐，目标多肽（蛋白）得率较低。2）分子克隆得到cDNA序列，推导出氨基酸序列，氨基酸组成数目较少的多肽再通过化学合成得到蛋白，部分通过克隆表达得到文蛤多肽（蛋白），然后再分析其活性和功能；该方法可以避免天然文蛤多肽（蛋白）提取纯化中的诸多不足。3）水解文蛤肉，然后分离纯化鉴定，在抗氧化多肽、ACE抑制肽的制备中应用较多，用酶催化水解文蛤蛋白，使整合在蛋白质分子中的多肽序列释放出来，具有各种生物活性；酶水解包括使用单一酶或复合酶对蛋白进行水解，其中利用复合酶水解蛋白时可采用顺序加入或同时加入的方式进行水解。

4 展望

文蛤资源丰富，主要分布于东南亚国家沿海一带，其软体部富含多种生物活性物质而备受国内外医药界的重视，目前研究已取得了丰硕的成果，但要进一步推动文蛤活性肽／蛋白开发应用尚存在一些需要解决的问题：1）文蛤体内活性物质种类多，但对已发现的各种文蛤活性肽的作用机制、药理作用及开发应用未能深入研究，仅对文蛤抗肿瘤肽进行了深入研究，对其它成分及活性研究还不够深入，如发现的几十种文蛤多肽（蛋白），仅对文蛤溶菌酶的高级结构进行了解析；2）因为文蛤生长分布地域的特点，研究者主要集中在中国和东南亚少数几个国家，应进一步加强国际合作，让更多的国家和研究者参与进来，使文蛤基础科学研究再上台阶；3）文蛤肉富含多种活性蛋白质或多肽，贝壳中含有丰富的矿物元素，应重视综合利用；4）以文蛤作为传统中药和民间秘方为基础，加强文蛤药物的开发和市场推广，并对文蛤作为中药的抗病作用机制开展进一步探讨。