IL-10、AECA在自身免疫肺气肿大鼠中的作用研究

李本雪 李夏 张湘燕，3 张程，，3△

(1.遵义医科大学，贵州 遵义 563000；2.贵州省人民医院呼吸与危重症医学科，贵州 贵阳 550002；3.贵州省人民医院·国家卫生健康委员会肺脏免疫性疾病重点实验室，贵州 贵阳 550002)

众所周知，慢性阻塞性肺疾病(COPD，简称慢阻肺)患者戒烟后，其气道炎症和肺部损害持续存在，甚至有逐渐加重的趋势，考虑这种现象与体内存在的自身免疫反应有关，故有学者提出自身免疫肺气肿这一概念，且得到广泛的关注及研究，并认为是阻塞性肺疾病不断进展的重要缘由[1]。在慢阻肺的发病过程中炎症细胞及其产生的炎症因子起着重要的作用，而肺泡灌洗液中常见的炎症因子，如IL-8、MMP-9、INF-α等在自身免疫肺气肿模型中已有相应研究报告[2]。IL-10作为体内抑炎因子的代表，可抑制多种炎症细胞因子的产生从而起到抗炎作用，在气道炎症反应过程中起着重要的作用[3]。查阅文献，IL-10在自身免疫肺气肿中的作用至今还无相关研究报道。另一方面，动物实验中已证明异种内皮细胞可诱导具有免疫功能的大鼠发生肺气肿，出现AECA[1]。而AECA是一种异质性自身免疫性抗体，可与内皮细胞中的多种蛋白相结合，参与许多自身免疫性疾病的发生。本实验通过向大鼠腹腔内注射异种内皮细胞建立自身免疫肺气肿模型，研究抗炎细胞因子IL-10及自身抗体AECA在该模型气道中的表达变化。

1 材料与方法

1.1实验材料 IL-10、AECA ELISA试剂盒购于欣博盛生物科技有限公司，脐带来源于贵州省人民医院及中医学院附属医院产科(医院伦理委员会备案，征得产妇知情同意)。

1.2人脐静脉内皮细胞培养 在路苹[4]实验方法基础上加以改良，对人脐静脉以胶原酶进行消化，然后培养至1×107。

1.3实验动物及分组 健康清洁级雄性SD大鼠由重庆市腾鑫科技公司有偿提供[许可证号：SCXK-(军)2012-0011，NO：0052464]。10周龄大鼠，体质量(200±20) g，随机将大鼠分成模型组和对照组，每组10只。根据国外实验[1]方法建立大鼠模型，人脐静脉内皮细胞培养至1×107加完全弗氏佐剂1 mL制成悬混液大鼠腹腔内注射。对照组予完全弗氏佐剂1 mL腹腔注射。21 d可建模成功。

1.4肺组织病理观察及形态学分析 21 d后处死大鼠，右肺行HE染色观察肺组织切片，随机选取HE染色切片3个视野(400倍)，尽量避开大支气管及血管，定量测MLI、MAN[5]。

1.5BALF的收集及检测 在气管下端做V型切口，用50 mL注射器针头(尖端磨平)插入气管内，向左肺注入1 mL PBS冲洗回抽，重复3次，收集到离心管中离心，离心所得上清液即为肺泡灌洗液，参照试剂盒说明书检测BALF中的IL-10、AECA。

2 结 果

2.1大鼠肺组织病理变化 镜下观察到模型组大鼠肺组织可见广泛性的肺泡扩张，局部肺泡间隔变薄并断裂，相邻肺泡融合成较大的囊腔，形成肺大泡；对照组大鼠肺组织无肺气肿病理改变(见图1)。定量测定MLI及MAN，可见模型组大鼠MLI增加，而MAN减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

注：A.对照组；B.模型组。

图1大鼠肺组织病理变化(HE×400)

表1 两组大鼠MLI、MAN比较

注：与对照组比较，aP<0.05。

2.2BALF中AECA及IL-10浓度变化比较 与对照组比较，模型组肺泡灌洗液中AECA浓度明显升高，而IL-10浓度较对照组降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组大鼠BALF中AECA、IL-10含量比较

注：与对照组比较，aP<0.05。

2.3模型组大鼠BALF中AECA与IL-10的相关性 对模型组大鼠BALF中AECA浓度与IL-10浓度行相关性分析，发现AECA与IL-10有相关性，且呈负相关(r=-0.64，P<0.05)。

3 讨 论

近年来，自身免疫反应在慢阻肺发病中的作用受到越来越多的关注，但其具体机制目前尚不明确[6]。本实验参照国外学者及我们前期课题组的实验方法建立自身免疫肺气肿模型[1，7]。通过镜下病理学观察发现模型组大鼠肺组织出现肺泡壁破坏、肺泡腔扩大等肺气肿样改变，且通过测量MLI及MAN，进一步证实了肺气肿模型建立成功。而与其他方式如香烟等建立的慢阻肺模型是否有差异，至少镜下观察未发现。而该模型对进一步研究自身免疫肺气肿提供了基础。

AECA是抗中性粒细胞胞浆抗体家族中的一种能够识别血管内皮细胞表面的抗原决定簇，导致血管内皮细胞激活，诱导细胞凋亡[8]。AECA与多种以血管炎为特点的自身免疫性疾病的发病有关，如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎等[9]。M.Karayama等[10]研究发现，慢阻肺患者血清中AECA较正常对照组升高，表明了AECA可能与慢阻肺的发病有关。国内学者[11]用烟雾建立肺气肿大鼠模型，发现肺气肿组大鼠血清中AECA较正常组升高，且血清中AECA含量与大鼠肺泡隔细胞凋亡呈正比。国内外相关证据[12-14]表明，AECA的增加可促进自身免疫反应的产生，从而增加肺泡隔细胞(主要包括肺泡上皮细胞和血管内皮细胞)凋亡，提示AECA及细胞凋亡均参与自身免疫肺气肿的形成，并称为慢阻肺的第四个发病机制。由此可见，AECA与自身免疫肺气肿的形成有较大关系，且呈促进作用。此次实验复制的肺气肿大鼠模型BALF中AECA的含量较对照组明显升高，进一步证实了该模型属于自身免疫肺气肿。

IL-10是一种抑炎因子，在抑制促炎细胞因子的产生方面具有广泛的作用[15]。IL-10主要来源于单核巨噬细胞和T辅助细胞，通过抑制炎症细胞的活化及细胞因子的产生而发挥其生物活性，如促进TNF-α的降解，使IL-6、IL-8及IL-10等因子的mRNA稳定性降低，而这些作用可能与抑制细胞因子mRNA的合成有关[16-17]。IL-10有抑制气道炎症作用，主要是通过抑制呼吸道中性粒细胞和肺泡巨噬细胞分泌炎性细胞因子，而其抑制效应发生在mRNA转录和翻译水平[18]。有研究[19]表明，对于急性肺损伤上调IL-10的表达可抑制炎症细胞的聚集及激活，从而阻止炎症反应放大、减轻炎症反应、减轻肺损伤及肺气肿，说明IL-10对肺损伤具有保护作用。而李雪莲等[20]对比慢阻肺患者血浆中IL-10水平，经治疗后明显升高，并认为是慢阻肺气道炎症的保护性因子。并有学者[21]建议监测IL-10可作为呼吸气道炎症的参考指标。本实验提示自身免疫肺气肿大鼠BALF中IL-10水平明显降低，所以IL-10的下调与AECA的增加共同参与了大鼠自身免疫肺气肿的形成。采用直线相关分析表明模型组大鼠BALF中AECA与IL-10呈负相关，而作为一种自身免疫性抗体的AECA，猜测可能通过抑制IL-10的表达从而参与了大鼠自身免疫肺气肿的形成，那么是否可外源性地提供IL-10，从而将对慢阻肺患者肺组织起到保护性作用，具体还需进一步研究加与佐证。