EFNB2 基因rs550067317 位点基因多态性与精神分裂症相关性研究

汪 斌 项则文 陈 莹 蔡 靓

精神分裂症是一种慢性、严重和致残的精神疾病，其临床特征是幻觉、妄想和认知缺陷，其遗传度高达80%[1]。EFNB2 基因位于13q33 染色体上，与精神分裂症有很强的联系。研究发现，EFNB2 基因与中国汉族人群中的精神分裂症有关[2]。研究表明，microRNA 表达失调可能与精神分裂症相关[3-5]。microRNA-137（miR-137）的变异是迄今为止鉴定的与精神分裂症风险相关性最为密切的基因座之一，与较差的认知表现有关。与miR-137 相关的精神分裂症风险可能与其更广泛的下游遗传效应有关[6]。rs550067317 位于EFNB2 基因的3’-UTR，该区域是miR-137 的结合位点，本研究探讨EFNB2 基因rs550067317 位点单核苷酸多态性与精神分裂症的相关性，同时分析miR-137 的作用，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选择2015 年8 月—2017 年12月期间浙江省绍兴市第七人民医院精神科收治的85例精神分裂症患者作为研究对象，选择同期健康体检者85 名作为对照，本研究通过医院伦理委员会的审核，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 精神分裂症诊断标准 参考美国精神障碍诊断与统计手册第四版（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disor-ders，DSM-IV）[7]。

1.3 纳入、排除标准 纳入标准：（1）年龄≥20 岁；（2）有两名精神科主治医生根据DSM-IV 标准确诊为精神分裂症。排除标准：（1）根据DSM-IV 诊断为精神发育迟滞、心境障碍、谵妄、分裂情感障碍、痴呆等精神类疾病；（2）有严重的脏器功能障碍；（3）处于哺乳期或者妊娠期的患者。

1.4 基因型分析 所有受试者均被抽取约2mL 静脉血，使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，保存于-20℃冰箱待测。根据美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库中EFNB2 基因rs550067317 位点信息设计引物，上游引 物 序 列 为F：5’-TACTGGCACTAAGATACACAG CTCCGAGCT-3’。下游引物序列为R：5’-GTATCTT AGTGCCAGTACCACAACAGTCCT-3’。使用25μL 的PCR 反应体系扩增，包含50ng 模板DNA，10×PCR缓冲液2.5μL，25mM Mg2+1.5μL，10mM dNTP 0.5μL，5U Taq 酶0.5μL，上下游引物各1μL，补双蒸水至25μL。PCR 反应程序为：95℃，4min；然后进入30 个循环的如下反应：94℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；然后72℃，10min。PCR 反应完成后将产物寄送上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果使用chromas 1.62 进行序列分析，结果见图1。

图1 EFNB2 基因rs550067317 位点测序结果

1.5 血浆miR-137 表达检测 取2mL 受试者EDTA 抗凝血，使用TRIzol（Invitrogen，USA）提取总RNA，使用反转录PCR 反转录成cDNA，试剂盒为TaqManmicroRNA 反转录试剂盒（ThermoFisher，批号4366596），每个样本重复测量2 次，以GAPDH 为外参，计算miR-137 的阈值环（threshold cycle，Ct）的差，并用2-△△Ct 表示miR-137 的相对表达水平。GAPDH 反转录qPCR 正向引物序列为5’-CCAAGG TCATCCATGACAACT-3’，反向引物为5’-CAGGGA TGATGTTCTGGAGAG-3’。miR-137 反转录qPCR 正向引物序列为5’-TTATTGCTTAAGAATACGCGTAG-3’，反向引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’。

1.6 统计学方法 使用SPSS20.0 软件进行统计分析，计数资料的表示方法为频数[n（%）]，组间差异采用χ2检验，基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡采用χ2检验。采用非条件Logistic 回归模型估计优势比（OR）和95%置信区间（CI）。计量资料用均数±标准差（s） 表示，组间统计分析采用t 检验或单因素方差分析。采用非参数法估计计算受试者工作特征曲线（ROC）曲线下面积（AUC），P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 精神分裂症患者与健康对照者一般情况比较研究组85 例中男46 例，女39 例，年龄20～74 岁，平均（36.54±9.56）岁。对照组85 名中男42 名，女43名，年龄20～65 岁，平均（36.15±10.12）岁。研究组与对照组年龄、性别等差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

2.2 EFNB2 基因rs550067317 位点基因多态性与精神分裂症风险 EFNB2 基因rs550067317 位点基因型频率分布符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。研究组患者与对照组EFNB2 基因rs550067317 位点基因型频率之间差异有统计学意义（χ2=6.996，P=0.030），以野生型AA 为参考，杂合子（AC）不是精神分裂症的危险因素（OR=0.492，95%CI=0.203～1.182，P=0.082），纯合子（CC）是精神分裂症发生的保护因子（OR=0.300，95%CI=0.087～0.980，P=0.024），显性模型下精神分裂症发生风险降低（OR=0.414，95%CI=0.196～0.870，P=0.011），隐性模型下精神分裂症风险并未显著降低（OR=0.346，95%CI=0.102-1.112，P=0.081）。研究组患者EFNB2 基因rs550067317 位点C 等位基因频率显著低于对照组，差异有统计学意义（χ2=9.833，P=0.002），以A 等位基因为参考，C 等位基因是精神分裂症发生的保护因素（OR=0.413，95%CI=0.226～0.750，P=0.002），见表1。

2.3 miR-137 表达情况 RT-PCR 检测结果显示，精神分裂症患者血浆miR-137 水平显著高于对照组（P＜0.01），见表2。分析比较EFNB2 基因rs550067317位点不同基因型受试者血浆miR-137 水平，结果显示，AA 基因型受试者血浆miR-137 水平显著高于AC 基因型、AC 基因型显著高于CC 基因型（P＜0.01），见表3。

2.4 miR-137 基因表达对精神分裂症诊断价值 使用Graphpad Prism 7.0 作miR-137 水平诊断精神分裂症的ROC 曲线，结果显示，cut-off 值为2.45，即当miR-137 相对表达量为2.45 时诊断精神分裂症的价值最高，miR-137 诊断精神分裂症的AUC（曲线下面积）为0.8619，P＜0.0001，敏感度为72.94%，特异度为85.88%。当仅考虑rs550067317 位点野生型（AA）受试者时，miR-137 诊断精神分裂症的AUC（曲线下面积）为0.9791，P＜0.0001，敏感度为98.53%，特异度为95.59%，cut-off 值为3.75。当仅考虑rs550067317 位点突变型（AC+CC）受试者时，miR-137 诊断精神分裂症的AUC（曲线下面积）为0.8529，P=0.0004，敏感度为76.47%，特异度为76.47%，cut-off 值为2.25。见图2。

表1 EFNB2 基因rs550067317 位点基因型和等位基因频率[例（%）]

表2 研究组和对照组miR-137 相对表达水平比较（x±s）

表3 EFNB2 基因rs550067317 位点不同基因型受试者血浆miR-137 水平比较（x±s）

3 讨 论

虽然全基因组关联研究提供了一种系统的、有效的、无偏移的方法来研究复杂疾病如精神分裂症的常见变异，然而由于精神分裂症在不同人群中的遗传异质性，精神分裂症易感位点的识别在不同的研究中不能被重复[8-9]。尽管如此，通过病例对照全基因组关联研究发现，欧洲人体内miR-137 与精神分裂症之间的较强关联性在中国汉族人群中被重复[10]。miR-137 与EFNB2 结合的序列是保守的[11]，通过计算预测分析和报告基因分析，EFNB2 基因被miR-137 直接靶向调控。包括EFNB2 在内的肾上腺素B 的激活可以弥补Reelin 的缺失，而Reelin 信号是神经系统正常运作所必需的，这种通路的中断导致了异脑症，这是一种与精神分裂症相关的严重发育障碍[12]。既往研究表明，miR-137 调节成人神经发生、神经元成熟和突触前可塑性，miR-137 的过度表达导致突触小泡运输受损和突触可塑性改变[13]。Wu等[14]研究显示，EFNB2 作为miR-137 的直接靶标，miR-137 是精神分裂症的危险因素，可能与NMDA受体信号转导和/或Reelin 信号通路有关。

图2 miR-137 基因表达对精神分裂症诊断价值的ROC 曲线分析

通过本研究结果可以看出，EFNB2 基因rs550067317 位点C 等位基因频率显著低于对照组，以A 等位基因为参考进行非条件Logistic 回归模型估计结果显示，C 等位基因是精神分裂症发生的保护因素，说明携带A 等位基因的群体具有比C 等位基因携带者具有更高的精分裂症风险。本研究结果还显示，AA 基因型受试者血浆miR-137 水平显著高于AC 基因型、AC 基因型显著高于CC 基因型（P＜0.01）。根据Wu 等[14]研究结果发现，内源性EFNB2表达在蛋白质水平上可以被miR-137 下调，rs550067317 位点位于3’-UTR 与miR-137 的结合位点上，C 等位基因影响miR-137 与EFNB2 基因3’-UTR 的结合，进而影响miR-137 对EFNB2 表达的调控作用，具体表现为A 等位基因EFNB2 低表达，被miR137 抑制，C 等位基因EFNB2 高表达。

此外，在使用ROC 曲线分析miR-137 诊断精神分裂症时发现，以EFNB2 基因rs550067317 位点所有基因型为对象，AUC 为0.8619，P＜0.0001，敏感度为72.94%，特异度为85.88%，cut-off 值为2.45。当仅考虑rs550067317 位点野生型（AA）受试者时，miR-137 诊断精神分裂症的AUC 为0.9791，P＜0.0001，敏感度为98.53%，特异度为95.59%，cut-off 值为3.75。当仅考虑rs550067317 位点突变型（AC+CC）受试者时，miR-137 诊断精神分裂症的AUC 为0.8529，P=0.0004，敏感度为76.47%，特异度为76.47%，cut-off值为2.25。由此结果可知，野生型型群体中miR-137诊断精神分裂症的价值高于突变型。

本研究有以下不足之处。首先，没有建立EFNB2表达模型验证EFNB2 基因rs550067317 位点单核苷酸多态性与EFNB2 表达以及与血浆miR-137 水平的相关性；其次，样本量较小，可能影响统计结果的准确性。

综上所述，EFNB2 基因rs550067317 位点基因多态性与精神分裂症风险相关，血浆miR-137 水平检测精神分裂症具有较高的诊断价值，其中野生型群体中诊断价值最高，敏感度高达98.53%，特异度高达95.59%。