血清miRNA-10a 与IL-35 水平对脓毒症诱导急性肾损伤患者预后评估价值

朱先华

脓毒症是一种严重危及生命、预后较差的临床危重症，短期预后死亡率近三分之一[1]。脓毒症患者由于全身炎性反应综合征，诱发多器官功能障碍综合征，最后导致多器官功能衰竭，其中脓毒症导致的急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）最为多常见，也是导致患者预后结局不良的主要病因之一[2]。寻找有效、便捷的早期诊断及判断预后的血清学指标，对于临床有效阻止脓毒症诱导AKI 的发生，改善患者预后具有重要意义[3]。目前临床常用降钙素原（procalcitonin，PCT）、肾损伤分子1（kidney injury molecule-1，KIM-1）、胱抑素C（cystatin C，Cys-C）、序贯器官衰竭评分（sequential organ failure assessment，SOFA）等指标来早期评估脓毒症诱导AKI 发生，但是对于评估患者病情及预后的准确度较差，因此寻找更准确的血清指标仍是临床热点问题[4]。临床研究显示，微小RNA-10a（miRNA-10a）及白细胞介素-35（interleukin-35，IL-35）对于脓毒症病情评估具有一定的临床价值[5]，但是血清miRNA-10a 及IL-35 水平对脓毒症诱导AKI 患者预后的评估价值尚未见报道，故本研究对此探讨。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016 年6 月—2018 年6 月在浙江省临海市第一人民医院ICU 住院治疗的脓毒症患者90 例作为研究对象，其中男44 例，女46 例，平均年龄（56.7±10.9）岁；所有研究对象按有无AKI 发生分为两组，观察组42 例，对照组48 例。本研究符合临床试验研究法规及赫尔辛基宣言，通过本院伦理委员会审核，未对研究对象造成有害或不利的损害，研究结果对患者诊疗有益，纳入研究过程完全尊重患者或其直系亲属及监护人的意见，研究过程中遵从自愿原则。患者直系亲属或监护人均书面签署知情同意书。

1.2 纳入、排除标准 纳入标准：（1）符合2001 年国际脓毒症释义会议确定的脓毒症诊断标准[6]；（2）符合阿姆斯特丹AKI 合作研究会确定的AKI 诊断标准[7]。排除标准：（1）合并有自身免疫性疾病或接受免疫调节治疗；（2）合并恶性肿瘤晚期或严重脏器功能不全；（3）研究期内不能坚持随访，临床资料不完整者。

1.3 血清标记物检测 两组患者检查时间点选择为入院即刻、治疗后第3、7、14 及28 天，均于清晨空腹抽外周血3～5mL，应用2000r/min 转速离心10min，分离得血清采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测样本IL-35 以及PCT 浓度，测定IL-35 以及PCT 所用ELISA 试剂盒均购自美国BD 公司，操作流程依据ELISA 试剂盒说明书逐步进行。采用免疫比浊法测定血清Cys-C水平，采用双抗体夹心酶标免疫分析法测定血清KIM-1 水平，Cys-C 及KIM-1 测定试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司。血清肌酐（serum creatinine，Scr）浓度由检验科用全自动生化分析仪检测。

1.4 血清miRNA-10a 检测 采用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术检测血清miRNA-10a 表达水平。两组患者均于入院即刻、治疗后第3、7、14 及28 天，抽取5mL 外周血样本，采用miRNA 检测试剂盒（购自美国Invitrogen 公司）提取血清miRNA，再采用逆转录试剂盒（购自美国Fermentas 公司）逆转录成cDNA 链，依据检测试剂盒说明书进行具体操作流程。内参为小核RNA U6（snRNA U6），上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGC ACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCG T-3’。miRNA-10a 上游引物：5’-GGAGGGGTACCAGAATCCCATTTTGGCCA-3’，下游引物：5’-GGAGG AAGCTTGCGGAGTGTTTATGTCAACT-3’。

PCR 反应体系和条件按照试剂盒说明书确定，具体为：预变性95℃、5min；95℃、10s 变性，60℃、20s退火，72℃、20s 延伸，40 个循环。以2-ΔΔCt 表示观察组miRNA-10a 相对于对照组的表达水平，ΔCt=Ct目标-Ct 内参。

1.5 序贯器官衰竭评分 两组均进行全身性感染相关性器官功能衰竭评分（sepsis related organ failure assessment，SOFA），主要分为呼吸（PaO2/FiO2、呼吸支持）、凝血系统（血小板）、肝功能（胆红素）、循环系统（平均动脉压、多巴胺、肾上腺素、去甲肾腺素、多巴酚丁胺剂量）、神经系统评分、肾脏系统（肌酐、24h 尿量）六部分组成，其中每项分值为0～4 分，总分值0～48 分，分数越高，预后越差。SOFA 评分由两名ICU专科副主任医师进行评估。

1.6 预后分析 所有纳入研究患者出ICU 后均通过电话询问方式随访3 个月，随访间隔1 个月。记录死亡例数以及各自死亡原因，其中死亡主要原因为多器官功能衰竭12 例、急性肾衰竭9 例、全身炎症反应8 例、DIC 5 例。根据患者随访期间预后结局分为两组，生存组56 例，死亡组34 例。

1.7 统计学方法 应用SPSS 21.0 统计软件。符合正态分布且齐性检验的计量资料以均数±标准差（±s） 表示，不同时间点血清指标动态水平比较采用重复测量数据的方差分析，生存组与死亡组治疗第1天血清miRNA-10a 与IL-35 水平比较采取成组t 检验。计数资料以频次或百分比表示，比较采用χ2检验。采用Pearson 相关分析分别评估血清miRNA-10a、IL-35 与PCT、Scr、KIM-1、Cys-C 及SOFA 评分间的相关性。应用多元Logistic 回归分析上述指标与生存率的相关性。应用受试者工作特征曲线（ROC）方法评估血清miRNA-10a 与IL-35 水平对患者预后的评估价值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组一般资料比较 观察组42 例，男20 例，女22 例，平均年龄（55.1±8.8）岁，体质指数（BMI，18.7±2.1）kg/m2；对照组48 例，男24 例，女24 例，平均年龄（57.7±11.3）岁，BMI（17.9±1.5）kg/m2。两组患者年龄、性别、体质指数等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 两组脓毒症诱导急性肾损伤患者不同时间点血清指标动态水平比较（x±s）

表2 脓毒症诱导AKI 患者各指标相关性分析

2.2 两组不同时间点血清指标水平比较 与入院即刻比较，对照组不同时间点间血清PCT 及SOFA 评分差异有统计学意义（P 均＜0.05），血清miRNA-10a、IL-35、Scr、KIM-1、Cys-C 差异无统计学意义（P均＞0.05）；观察组不同时间点间血清miRNA-10a、IL-35、PCT、Scr、KIM-1、Cys-C 及SOFA 评分自治疗第3 天始随治疗时间延长逐渐降低（P 均＜0.05）；观察组与对照组各时间点血清miRNA-10a、IL-35、Scr、KIM-1 及Cys-C 水平差异有统计学意义（P 均＜0.05），观察组各时间点血清PCT 水平、SOFA 评分与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.3 相关性分析 Pearson 相关分析显示，脓毒症诱导AKI 患者血清miRNA-10a、IL-35 分别与血清KIM-1、Cys-C 正相关（r=0.781，P=0.032、r=0.835，P=0.027；r=0.842，P=0.026、r=0.864，P=0.024），见表2。

2.4 生存组与死亡组指标比较 生存组血清miRNA-10a 与IL-35 水平显著低于死亡组（P 均＜0.05），见表3。

2.5 与生存率相关因素多元Logistic 回归分析 以随访3 个月生存率为应变量，血清miRNA-10a、IL-35、PCT、Scr、KIM-1、Cys-C、SOFA 评分为自变量，应用全模型多元Logistic 回归分析方法进行回归分析，结果显示，血清miRNA-10a（OR=3.157，P=0.016）与IL-35（OR=2.426，P=0.027）为脓毒症诱发AKI 患者预后危险因素，见表4。

表3 生存组与死亡组治疗后第3 天血清指标比较（x±s）

2.6 血清miRNA-10a 与IL-35 联合诊断的ROC 曲线分析 应用ROC 曲线评估治疗第1 天血清miRNA-10a 与IL-35 预测脓毒症诱发AKI 患者的随访3 个月预后不良的价值，结果显示，血清miRNA-10a截断值为3.15，预测脓毒症诱导AKI 患者随访3 个月预后不良发生的曲线下面积（AUC）为0.783，P 值为0.042，灵敏度77.9%（95%CI：0.733～0.835），特异度82.6%（95%CI：0.793～0.854）；血清IL-35 截断值为355pg/mL，预测随访3 个月预后不良的AUC 为0.806，P 值为0.037，灵敏度77.9%（95%CI：0.733～0.835），特异度90.1%（95%CI：0.733～0.835）；血清miRNA-10a 与IL-35 联合检测预测脓毒症诱导AKI患者随访3 个月预后不良发生的AUC 为0.852，P 值为0.032，其预测短期预后不良的灵敏度为85.6%（95%CI：0.810～0.924），特异度为87.9%（95%CI：0.826～0.941），见图1。

表4 临床指标多元Logistic 回归分析比较

图1 治疗前血清miRNA-10a 与IL-35 水平预测脓毒症诱导AKI 患者预后的ROC 曲线

3 讨 论

脓毒症患者体内内毒素以及过量炎症介质破坏凝血-纤溶系统平衡，促使肾脏微血管内形成微血栓，降低肾小球灌注压及滤过率，导致AKI 发生[8]。脓毒症早期肾功能损害是可逆，但进展迅速，肾实质损害严重且不可逆，即便全面支持对症处理也不能改善患者预后，因此脓毒症诱导AKI 治疗的关键是早期预测、及早发现高危患者，在肾功能损害早期即予以充分有效治疗措施，能有效逆转肾功能，改善临床症状及短期预后[9]。

miRNA-10a 是调控脓毒症免疫应答水平的关键因子之一，其水平高低直接关系到患者病情发展及预后，且早期评估脓毒症病情及预后具有较好特异性和敏感性[9-10]。国外研究显示，miRNA-10a 能调节辅助性T 细胞比例，提高TNF-α 及IL-2 等炎性因子水平，调节整体免疫网络[11-12]。miRNA-10a 表达异常与脓毒症诱发AKI 的免疫失衡程度存在相关性，因此被认为是今后脓毒症诱发AKI 的重要治疗靶点[13]。IL-35 是机体免疫系统调节的重要细胞因子之一，能有效地改善多种炎症疾病病情，延缓进展。IL-35 能抑制机体炎症反应，平衡特异性免疫应答反应[14-15]。脓毒症患者循环IL-35 能抑制IL-2与IFN-γ 生成，上调IL-10 分泌及调节型T 细胞比例，对过度激活免疫系统起到抑制效应，因此被认为是脓毒症诱导AKI 治疗的重要血清标志物[16-18]。

本研究结果显示，在治疗后四个时间点，两组血清miRNA-10a、IL-35、Scr、KIM-1 及Cys-C 水平均存在差异，且观察组均高于对照组（P＜0.05），提示血清miRNA-10a 与IL-35 水平能反映脓毒症患者可能发生AKI。随着治疗持续进行，各项血清指标水平也呈进行性降低，存在治疗时间的差异性，提示血清miRNA-10a 与IL-35 动态改变与脓毒症诱发AKI病情可能存在一定关系，这为监测两种指标水平变化来指导治疗方案提供临床依据[19]。目前临床评估AKI 病情的血清学指标多为KIM-1 及Cys-C，本研究直线相关分析显示，血清miRNA-10a 与IL-35 水平与血清KIM-1 及Cys-C 均呈正相关。因此血清miRNA-10a 与IL-35 对评估脓毒症诱发AKI 病情具有较好临床价值。Scr 与SOFA 评分两组患者无显著差异，同时与血清miRNA-10a 与IL-35 水平也无相关性，提示临床通过检测血清Scr 与SOFA 评分难以评估AKI 的发生[20]。

通过短期3 个月随访，生存组治疗后第1 天的血清miRNA-10a 与IL-35 水平低于死亡组，提示治疗早期血清miRNA-10a 与IL-35 水平与患者短期预后有相关性。血清miRNA-10a 与IL-35 被多元Logistic 回归分析证实是脓毒症诱发AKI 预后的危险因素，提示动态监测血清miRNA-10a 与IL-35 能早期评估脓毒症诱发AKI 患者生存状况。本研究也证实，单用血清miRNA-10a 或IL-35 预测脓毒症诱发AKI 患者的短期预后临床价值不理想，而两者联合检测的敏感性和特异性提高明显，因此诊断价值更高。