青蒿琥酯增强顺铂对前列腺癌细胞杀伤活性及作用机制研究

周丽娜

前列腺癌严重威胁男性健康。尽管手术是治疗前列腺癌的最佳手段，但对于进行术后辅助治疗或中晚期前列腺癌患者而言，系统性化疗仍是不可或缺的治疗方案[1]。然而，一些肿瘤细胞对化疗敏感性的降低是目前面临的重大问题。顺铂是一种常见的铂类化疗药物，其抗癌谱十分广泛。肿瘤细胞摄入顺铂后，肿瘤细胞中DNA 会与顺铂发生不可逆性交联反应，从而使其受损并丧失正常功能，进而诱导肿瘤细胞发生凋亡性死亡[2-3]。然而长期大剂量使用顺铂会严重降低肿瘤细胞对顺铂的敏感性，并对患者造成严重的副反应。因此，采用适当的辅助治疗提高顺铂的抗前列腺癌活性以降低顺铂的使用剂量具有十分重要的临床意义。本研究观察体外联用青蒿琥酯对顺铂抗前列腺癌活性的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人前列腺癌细胞系LNCaP 购于美国模式培养物保存中心（ATCC）。细胞培养在RPMI-1640 培养基（含10%胎牛血清）中，放置于37℃恒温培养箱中培养并通入5%CO2。

1.2 试 剂 顺铂（批号C2210000），青蒿琥酯（批号A3731），噻唑蓝（MTT，批号M2128）和凋亡检测试剂盒（批号APOAF）购于德国Sigma-Aldrich。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，批号#5174）、间质表皮转化蛋白（Met，批号#8198）、蛋白激酶B（AKT，批号#4691）、磷酸化AKT（批号#4060）、Bcl-2 相关细胞死亡激动子（Bad，批号#9268）、磷酸化Bad（批号#5284）、B 淋巴细胞瘤-2 蛋白（Bcl-2，批号#4223）、大分子B 淋巴细胞瘤蛋白（Bcl-xl，批号#2764）、半胱天冬酶-9（caspase-9，批号#9502）和半胱天冬酶-3 （caspase-3，批号#9665） 抗体购于美国Cell Signaling。增强化学发光底物（ECL）显色试剂盒（批号32106）购于美国Pierce。脂质体2000（Lipofectamine2000，批号11668019）购于美国Invitrogen。蛋白G 免疫共沉淀琼脂糖（批号sc-500778）购于美国Santa Cruz。

1.3 Met 真核表达载体构建及转染 采用重组质粒转染的方法进行Met 过表达，将人Met 基因开放阅读框架序列用PCR 扩增，将扩增后的基因片段以分子克隆方法与pcDNA3.1 连接后构建成Met 重组过表达质粒。顺时转染简要步骤如下：将2μg/mL Met重组质粒或空质粒用脂质体2000 进行包裹，静置15min 后将其与无血清培养基混合。贴壁培养的肿瘤细胞用该包含质粒的培养基继续孵育6h。随后吸走该包含质粒的培养基，加入新鲜的RPMI-1640 培养基（含10%胎牛血清）常规培养24h，收集细胞用于后续实验。

1.4 细胞活力抑制率检测 按5×103/孔在96 孔板上接种LNCaP 细胞并孵育过夜，用于进行分组实验。实验分为对照组、青蒿琥酯组、顺铂组、顺铂+青蒿琥酯组和顺铂+青蒿琥酯+Met 质粒组。对照组为空质粒转染的LNCaP 细胞不加药物处理，青蒿琥酯组为空质粒转染的LNCaP 细胞用10μM 青蒿琥酯处理，顺铂组为空质粒转染的LNCaP 细胞用2μM 顺铂，顺铂+青蒿琥酯组为空质粒转染的LNCaP 细胞用2μM 顺铂和10μM 青蒿琥酯联合处理，顺铂+青蒿琥酯+Met 质粒组为Met 质粒转染的LNCaP 细胞用2μM 顺铂和10μM 青蒿琥酯联合处理。各组细胞培养48h 后，加入20μL MTT 溶液（5mg/mL）并继续培养4h。吸走上清液，加入二甲亚砜，充分震荡后用酶标仪检测其吸光度（570nm 波长）。LNCaP 的细胞活力抑制率用以下公式计算：细胞活力抑制率=（吸光度对照组-吸光度药物处理组）/吸光度对照组×100%。

1.5 免疫共沉淀 按1.4 所述进行分组处理LNCaP细胞，之后对LNCaP 细胞进行计数。将等量的各组细胞用细胞裂解液在冰上进行裂解，裂解30min 后将裂解产物离心10min（12000rpm）并采集上清液。将上清液分成等量两份，一份用作内参（Input），另一份进行免疫共沉淀（IP）。在共沉淀体系中加入Bad 抗体并在4℃下孵育过夜，之后在共沉淀体系中加入蛋白G 琼脂糖珠并在室温摇床下作用2h。孵育完成后将该共沉淀产物离心5min（12000rpm）。之后吸走上清液，用Western blot 上样缓冲液进行重悬并在沸水下浴煮5min。处理后的共沉淀体系可直接用于Western blot 实验。

1.6 Western blot 试验 直接提取的等量总蛋白质或1.5 所述所得样品用10% SDS-PAGE 进行电泳分离。所得的蛋白分离胶再用电转方法将其中的蛋白质转移到PVDF 膜上。用5%脱脂奶粉对PVDF 进行封闭孵育2h，再将PVDF 膜用GAPDH、Met、AKT、磷酸化AKT、Bad、磷酸化Bad、Bcl-2、Bcl-xl、caspase-9和caspase-3 抗体在4℃下孵育过夜。之后将该PVDF 膜用洗涤缓冲液清洗2 次后用带辣根过氧化物酶的二抗室温孵育2h，用增强型化学发光底物（ECL）试剂盒检测PVDF 膜上的蛋白条带。目的蛋白的相对表达用目标蛋白灰度值与GAPDH 灰度值的比值表示，蛋白灰度值分析用Image J 软件处理。

1.7 细胞凋亡试验 按1.4 所述进行分组处理LNCaP 细胞，之后对LNCaP 细胞进行计数，取2×106的各组细胞按照凋亡检测试剂盒说明书步骤用Annexin-V 和碘化丙啶（PI）对细胞进行染色孵育20min，之后用生理盐水洗涤2 次，细胞用生理盐水重悬后用流式细胞术检测LNCaP 细胞Annexin-V的荧光强度。Annexin-V 阳性的LNCaP 细胞即为凋亡细胞。

1.8 统计学方法 实验数据由3 次重复实验而得，以均数±标准差（±s） 表示。多组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），统计分析软件为SPSS 15.0，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 青蒿琥酯在体外增强顺铂对前列腺癌细胞杀伤活性 MTT 实验结果显示，顺铂+青蒿琥酯组LNCaP细胞活力抑制率、凋亡率均高于青蒿琥酯组和顺铂组（P 均＜0.05），见表1。

表1 青蒿琥酯和顺铂对LNCaP 细胞活力抑制率和凋亡率的影响（%，x±s）

2.2 青蒿琥酯通过下调Met 表达增强顺铂对前列腺癌细胞杀伤活性 Western blot 实验结果显示，青蒿琥酯能降低LNCaP 细胞Met 表达水平，顺铂对Met的表达水平无明显影响。另外，转染Met 表达质粒能使LNCaP 细胞Met 发生强制过表达，废除青蒿琥酯对Met 的抑制，见图1。同时，MTT 和流式细胞实验结果显示，青蒿琥酯+顺铂+Met 质粒组LNCaP 细胞活力抑制率和细胞凋亡率均低于顺铂+青蒿琥酯组（P＜0.05），见表1。

2.3 青蒿琥酯通过Met/AKT/Bad 途径促进顺铂诱导的凋亡 免疫共沉淀实验结果显示，青蒿琥酯能明显诱导LNCaP 细胞Bad 与Bcl-xl 及Bcl-2 相互作用，见图2。同时，Western blot 实验结果显示，青蒿琥酯能明显促进顺铂诱导的caspase-9 和caspase-3的活化，见图3。然而，转染Met 质粒后，青蒿琥酯联合顺铂处理的LNCaP 细胞Bad 与Bcl-xl 及Bcl-2结合水平，caspase-9 和caspase-3 活化水平及凋亡水平均明显降低，见图2-3。

3 讨 论

青蒿琥酯是提取自菊科植物黄花蒿叶的天然活性成分，除抗疟作用外，还具有一定的抗肿瘤活性，能抑制一些肿瘤细胞增殖并阻滞其细胞周期[4-5]。然而，青蒿琥酯是否能提高顺铂对前列腺癌的杀伤活性，迄今还不明确。本实验结果发现，尽管青蒿琥酯单独处理对前列腺癌细胞系的杀伤活性较弱，但其能明显增强顺铂的抗前列腺癌活性，表明青蒿琥酯可以作为辅助治疗药物增强前列腺癌细胞对顺铂的敏感性，提高其疗效。

图1 青蒿琥酯、顺铂和Met 质粒处理对LNCaP 细胞Met 表达水平及AKT 和Bad 磷酸化水平的影响

图2 青蒿琥酯、顺铂和Met 质粒处理对LNCaP 细胞Bad 与Bcl-2 及Bcl-xl 相互作用的影响

图3 青蒿琥酯、顺铂和Met 质粒处理对LNCaP 细胞caspase-9、caspase-3 活化水平的影响

Met 是肝细胞生长因子（HGF）的受体。文献报道，高度活化的c-met 能促进肿瘤细胞的生长转移并抑制其凋亡途径，是一种原癌基因[6-9]。因此，Met 可作为肿瘤治疗的潜在靶点。在Met 下游通路中，AKT的激活是Met 发挥肿瘤促进作用的重要步骤[10]。另外，Bcl-2 促凋亡蛋白Bad 是AKT 激酶的作用底物，然而Bad 的促凋亡活性取决于其磷酸化状态。非磷酸化的Bad 能与Bcl-2 和Bcl-xl 这两种抗凋亡蛋白发生结合，使其失去活性从而发挥促凋亡活性。然而，当Bad 被AKT 激酶磷酸化后，磷酸化的Bad 会从其与Bcl-xl 或Bcl-2 形成的异二聚体中分离出来，从而使Bcl-xl 和Bcl-2 游离出来发挥抗凋亡作用[11-12]。本研究结果还表明，青蒿琥酯能明显抑制前列腺癌细胞Met 蛋白表达水平，从而抑制前列腺癌细胞AKT 磷酸化通路，使Bad 蛋白不能在AKT 激酶的作用下发生磷酸化，进而使Bcl-2 和Bcl-xl 蛋白失活以提高前列腺癌细胞对顺铂诱导的凋亡通路的敏感性，表现为凋亡执行蛋白caspase-9 和caspase-3 显著活化，诱导前列腺癌细胞发生凋亡性死亡。总之，本研究结果显示，青蒿琥酯可能通过Met/AKT/Bad 途径增强顺铂的抗前列腺活性。