非小细胞肺癌组织中p70 S 6 K、ProGRP、CXCR 2的表达情况及临床意义

杨金华，张慧青，穆林

长治医学院附属和平医院1呼吸内科，2普外科，山西 长治0460000

肺癌是临床中常见的恶性肿瘤，近年来肺癌的发病率和病死率日趋增加，已成为中国发病率和病死率最高的恶性肿瘤[1]。肺癌中最常见的类型为非小细胞肺癌。肺癌的发病机制较为复杂，研究表明，长期吸烟与肺癌的发生密切相关，其他因素还包括大气污染、职业暴露等外部诱因[2]。核糖体40S小亚基S6蛋白激酶（p70 ribosomal S6 protein kinase，p70S6K）属于雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）下游的直接作用底物，可影响蛋白质合成及细胞的增殖和凋亡，促进肿瘤细胞的浸润和转移[3]。胃泌素释放肽（gastrin releasing peptide，GRP）属于胃肠激素，研究发现，GRP可通过自分泌或细胞间的相互作用，参与肿瘤的生长和转移[4]。此外，免疫系统紊乱是恶性肿瘤发生、发展的重要环节，趋化因子是免疫系统的关键组成部分，CXC趋化因子受体2（C-X-C motif chemokine receptor 2，CXCR2）作为趋化因子家族成员，具有较强的粒细胞趋化和促血管生成作用[5]。本研究分析了非小细胞肺癌组织中p70S6K、胃泌素释放肽前体（pro-gastrin releasing peptide，ProGRP）和CXCR2的表达情况，旨在探讨其在非小细胞肺癌发生发展中的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年1月至2017年9月长治医学院附属和平医院收治的非小细胞肺癌患者的临床资料。纳入标准：①依据《内科学》[6]中的诊断标准，经术后病理学检查确诊为非小细胞肺癌；②具有石蜡标本；③术前未接受过放疗、化疗；④临床资料完整。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②合并原发性脑、肾、心、肝等器官功能障碍；③合并自身免疫性疾病。根据纳入和排除标准，本研究共纳入180例非小细胞肺癌患者。其中，男103例，女77例；年龄45～78岁，平均（62.74±8.30）岁；低分化68例，中高分化112例；有淋巴结转移57例，无淋巴结转移123例。收集患者的非小细胞肺癌组织标本及对应的癌旁正常组织（距肿瘤组织5 cm以上）标本各180例。

1.2 主要试剂

兔抗人p70S6K、ProGRP单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司，兔抗人CXCR2单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，即用型链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）试剂盒、二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学染色

取非小细胞肺癌组织标本和癌旁正常组织标本，采用免疫组织化学SP法检测组织标本中p70S6K、ProGRP、CXCR2的表达情况。所有标本均使用4%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，使用SP试剂盒染色，柠檬酸缓冲液煮沸修复，DAB显色，苏木素复染。以已知的阳性切片作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）作为阴性对照。

1.4 观察指标及判定标准

比较非小细胞肺癌组织和癌旁正常组织中p70S6K、ProGRP、CXCR2的阳性表达率，分析非小细胞肺癌组织中p70S6K、ProGRP、CXCR2阳性表达情况与非小细胞肺癌患者临床特征的关系，以及非小细胞肺癌组织中p70S6K、ProGRP、CXCR2表达的相关性。

由经验丰富的病理科医师在高倍镜（×400）下随机选取5个视野进行阅片。阳性细胞所占百分比评分：阳性细胞＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，＞50%为3分。染色强度评分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两项评分相加，＞2分为阳性，≤2分为阴性[7]。

1.5 统计学分析

采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p70 S 6 K、ProGRP、CXCR 2阳性表达率的比较

非小细胞肺癌组织中p70S6K、ProGRP、CXCR2的阳性表达率均明显高于癌旁正常组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 非小细胞肺癌组织和癌旁正常组织中 p70 S 6 K、ProGRP、CXCR 2阳性表达情况的比较[ n（%）]

2.2 不同临床特征非小细胞肺癌患者非小细胞肺癌组织中 p70 S 6 K、ProGRP、CXCR 2的阳性表达情况

不同性别、年龄的非小细胞肺癌患者非小细胞肺癌组织中p70S6K、ProGRP、CXCR2的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。肿瘤直径＞3 cm、低分化、有淋巴结转移的非小细胞肺癌患者非小细胞肺癌组织中p70S6K、ProGRP、CXCR2的阳性表达率均明显高于肿瘤直径≤3 cm、中高分化和无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（χ2p70S6K=16.001、9.938、16.637，P＜0.01；χ2ProGRP=15.262、11.521、15.019，P ＜ 0.01；χ2CXCR2=13.469、23.337、10.124，P＜0.01）。（表2）

表2 不同临床特征非小细胞肺癌患者非小细胞肺癌组织中 p70 S 6 K、ProGRP、CXCR 2的阳性表达情况（ n=180）

2.3 非小细胞肺癌组织中 p70 S 6 K、ProGRP、CX-CR 2的表达与非小细胞肺癌患者临床特征的相关性

非小细胞肺癌组织中p70S6K、ProGRP、CXCR2的表达与非小细胞肺癌患者的肿瘤直径、分化程度、淋巴结转移情况均呈显著正相关（P＜0.01）。（表3）

表3 非小细胞肺癌组织中 p70 S 6 K、ProGRP、CXCR 2的表达与非小细胞肺癌患者临床特征的相关性

2.4 非小细胞肺癌组织中 p70 S 6 K、ProGRP、CX-CR 2表达的相关性

Spearman相关分析结果显示，非小细胞肺癌组织中p70S6K与ProGRP、CXCR2的表达均呈显著正相关（r=0.387、0.418，P＜0.01），ProGRP与CXCR2的表达呈显著正相关（r=0.495，P＜0.01）。

3 讨论

p70S6K属于AGC蛋白激酶家族（包括蛋白激酶A、蛋白激酶G、蛋白激酶C），是MTOR下游的直接作用底物，而其磷酸化可启动蛋白翻译过程。研究发现，部分肿瘤患者中MTOR信号通路调控失常，如MTOR通路相关受体组成性激活、真核细胞起始因子4E及p70S6K的过度表达及扩增等[8]。研究发现，在结肠癌、宫颈癌等恶性肿瘤中，p70S6K均呈高表达且其在结肠癌和宫颈癌的发生发展中具有重要作用[9-10]。许浩然等[11]研究指出，高表达的p70S6K可作为非小细胞肺癌患者早期诊断和预后预测的标志物，并认为可通过调控p70S6K信号通路为肺癌患者提供新的治疗途径。本研究结果显示，非小细胞肺癌组织中p70S6K的阳性表达率明显高于癌旁正常组织，肿瘤直径＞3 cm、低分化、有淋巴结转移的非小细胞肺癌患者非小细胞肺癌组织中p70S6K的阳性表达率均明显高于肿瘤直径≤3 cm、中高分化和无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）。其原因可能是p70S6K通路激活对蛋白质合成、细胞增殖和凋亡具有重要影响，可促进血管生成，减少肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤的浸润、转移，参与肿瘤的形成和发展。

GRP属于蛙皮素类似物，最初于1978年由McDonald等从猪的非窦部胃上皮细胞中分离出来，之后发现在正常人脑、胃肠神经纤维、胎儿肺神经内也有GRP的部分表达。研究发现，小细胞肺癌细胞株和肿瘤组织分泌的GRP储存在细胞质中的高尔基体内，并可在适当条件下分泌到组织中，与细胞膜上的GRP受体结合，促进肿瘤细胞增殖，由此推测在非小细胞肺癌的诊断中，GRP可能是一种十分具有前景的标志物[12]。然而GRP在血浆中的半衰期仅为2 min，时间较短，检测较为困难，ProGRP是GRP的前体结构，已有研究证实，ProGRP可代表GRP的水平和基因表达情况[13]。本研究结果显示，非小细胞肺癌组织中ProGRP的阳性表达率明显高于癌旁正常组织，肿瘤直径＞3 cm、低分化、有淋巴结转移的非小细胞肺癌患者非小细胞肺癌组织中ProGRP的阳性表达率均明显高于肿瘤直径≤3 cm、中高分化和无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）。提示ProGRP在非小细胞肺癌的发生、发展中发挥关键作用。

趋化因子作为小分子蛋白质，是细胞因子中一大类特异性趋化白细胞物质，可通过与其受体结合参与多种病理生理过程。CXCR2属于谷氨酸-亮氨酸-精氨酸（ELR）阳性的CXC类趋化因子的公共受体，可与多种ELR阳性的CXC类趋化因子结合，参与肿瘤进展[14-15]。但目前有关CXCR2在非小细胞肺癌患者中表达情况的报道仍较少。胡剑等[7]研究发现，CXCR2表达情况与肺癌患者的临床分期、分化程度和血管浸润情况均有关。本研究结果显示，非小细胞肺癌组织中CXCR2的阳性表达率明显高于癌旁正常组织，肿瘤直径＞3 cm、低分化、有淋巴结转移的非小细胞肺癌患者非小细胞肺癌组织中CXCR2的阳性表达率均明显高于肿瘤直径≤3 cm、中高分化和无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）。其原因可能是CXCR2对肿瘤血管的生成具有促进作用，其表达升高可加速肿瘤血管生成，导致肿瘤的恶性程度升高。

本研究结果还表明，非小细胞肺癌组织中p70S6K与ProGRP、CXCR2的表达均呈显著正相关（P＜0.01），ProGRP与CXCR2的表达呈显著正相关（P＜0.01）。提示三者在非小细胞肺癌的发生发展过程中发挥协同促癌作用，但其具体作用机制仍需进一步深入研究。

综上所述，非小细胞肺癌组织中p70S6K、ProGRP、CXCR2的阳性表达率均较高，三者可能共同参与非小细胞肺癌的发生和发展。