ZIC 1过表达对三阴性乳腺癌细胞增殖及药物敏感性的影响△

史春桃，周英，程杰，王昊楠

1无锡市锡山人民医院普外科，江苏 无锡214000

2无锡市第五人民医院肿瘤科，江苏 无锡2140000

乳腺癌发生在乳腺腺上皮组织，目前已成为威胁女性生命健康的恶性肿瘤之一[1-2]。ZIC家族成员 1（Zic family member 1，ZIC1）基因已在多种肿瘤中被认为是一种潜在的抑癌基因[3-5]。近年来，化疗已成为乳腺癌主要的治疗方案之一，主要的化疗药物包括顺铂、环磷酰胺及多西他赛等[6-8]。此外，一些中药提取物也逐步被发现具有治疗乳腺癌的作用[9-10]。有研究发现，ZIC1基因在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中过表达后能够增强姜黄素对乳腺癌生长的抑制作用[11]。本研究旨在进一步确定过表达ZIC1基因对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468增殖能力及化疗药物敏感性的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDAMB-468均购自复旦IBS细胞资源中心。胎牛血清、DMEM培养液及胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；聚凝胺（polybrene）、噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl tetrazolium，MTT）、嘌呤霉素、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、顺铂、环磷酰胺、姜黄素及斑蝥素均购自美国Sigma公司；多西他赛及芹菜素均购自上海陶素生化科技有限公司；裂解液、上样缓冲液及BCA试剂盒均购自上海碧云天生物技术研究所；琼脂糖、Trizol、逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒以及定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）试剂盒均购自南京诺唯赞生物技术有限公司；兔抗人ZIC1多克隆抗体和小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体均购自北京Bioss公司。rLV-PGK-Puro和rLVZic1-PGK-Puro慢病毒载体均由武汉巴菲尔生物技术服务有限公司构建。

1.2 细胞培养及慢病毒转染

将乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468置于含10%胎牛血清和青霉素、链霉素的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2培养箱中培养。将对数生长期的MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞分别以每孔1×105个细胞接种于24孔板中，待细胞密度达50%时，更换含聚凝胺的新鲜无抗生素培养基，同时加入适量病毒悬液，即rLV-PGK-Puro或rLVZic1-PGK-Puro慢病毒载体，于37℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h，更换新鲜无抗体、无聚凝胺培养基。嘌呤霉素筛选出稳定表达ZIC1基因和空载体的MDA-MB-231细胞，作为A组和B组；嘌呤霉素筛选出稳定表达ZIC1基因和空载体的MDAMB-468细胞，作为C组和D组

1.3 蛋白质印迹（Western blot）法检测蛋白表达

取A组、B组、C组、D组稳定转染的细胞，加入适量裂解液，离心取上清，蛋白定量后，加上样缓冲液，煮沸，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电 泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），转膜，封闭，加入一抗工作液（ZIC1和GAPDH的稀释比为1∶1000），4℃过夜，TBST充分洗涤后加入二抗工作液（稀释比为1∶1000），室温下摇床中孵育2 h后曝光。ZIC1蛋白的相对表达量=ZIC1灰度值/GAPDH灰度值。实验重复3次，取均值。

1.4 实时荧光定量聚合酶链反应检测基因表达

取A组、B组、C组、D组稳定转染的细胞，滴加适量Trizol试剂提取RNA，逆转录合成cDNA。然后进行实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR），引物设计如下[12]：GAPDH正向引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'，GAPDH 反向引物 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'；ZIC1正向引物5'-GCGTCCTTTTGTGGATCTTTAA-3'，ZIC1反向引物5'-AGTAATCACATCTGCTTCTGGG-3'。反应条件：94℃ 4 min，95℃ 1 min，40个循环；60℃ 1 min，72℃ 1 min。获得阈值循环数 Ct值，采用 2-ΔΔCt法计算ZIC1 mRNA的相对表达量。实验重复3次，取均值。

1.5 MTT实验

1.5.1 MTT法检测细胞增殖取对数生长期的稳定转染细胞，离心重悬后，以每孔105个细胞接种于96孔板中，每组设5个复孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养，分别于培养12、24、36、48、60、72 h后加入新鲜配制的MTT溶液，37℃静置4 h后，加入DMSO，摇匀后于酶标仪490 nm波长处测定光密度（optical density，OD）值。实验重复 3次，取均值。

1.5.2 MTT法检测药物敏感性取对数生长期的稳定转染细胞，离心重悬后，以每孔105个细胞接种于96孔板中，每组设5个复孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养过夜，每孔加入100 μl不同浓度梯度的各化疗药物（顺铂：2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 µmol/L；环磷酰胺：0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 µmol/L；多西他赛：0.001、0.002、0.005、0.010、0.020、0.040 µmol/L）或中药提取物（姜黄素：2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0µmol/L；斑 蝥 素 ：2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 µmol/L；芹菜素：10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0µmol/L），并设对照组（不加化疗药物或中药提取物），然后置于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h，加入新鲜配制的MTT溶液，37℃静置4 h后，加入DMSO，摇匀后于酶标仪490 nm波长处测定OD值。细胞抑制率=（1-OD值给药组/OD值对照组）×100%。经Graphpad 6.0软件计算出半数抑制浓度（median inhibitory concentration，IC50）。实验重复3次，取均值。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0和Graphpad 6.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZIC 1 mRNA相对表达量的比较

qRT-PCR结果显示，A组细胞中ZIC1 mRNA的相对表达量为（2.303±0.170），明显高于B组的（1.048±0.011），差异有统计学意义（t=12.760，P＜0.01）。C组细胞中ZIC1 mRNA的相对表达量为（2.356±0.195），明显高于D组的（1.020±0.015），差异有统计学意义（t=11.844，P＜0.01）。

2.2 ZIC 1蛋白相对表达量的比较

Western blot结果显示，A组细胞中ZIC1蛋白的相对表达量为（1.318±0.135），明显高于B组的（0.208±0.043），差异有统计学意义（t=13.568，P＜0.01）。C组细胞中ZIC1蛋白的相对表达量为（1.259±0.180），明显高于D组的（0.262±0.037），差异有统计学意义（t=9.379，P＜0.01）。（图1）

图 1Westernblot法检测各组细胞中ZIC 1蛋白的表达情况

2.3 细胞增殖情况的比较

A、B、C、D组细胞的OD值均随培养时间的延长而升高。培养12 h时，A组和B组细胞的OD值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；C组和D组细胞的OD值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。培养24、36、48、60、72 h时，A组细胞的OD值均低于同时间点B组细胞，C组细胞的OD值均低于同时间点D组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同时间点各组细胞OD值的比较（±s）

表1 不同时间点各组细胞OD值的比较（±s）

注：a与同时间点B组比较，P<0.05；b与同时间点D组比较，P<0.05

时间（h）12 24 36 48 60 72 A组0.128±0.006 0.183±0.010a 0.217±0.018a 0.250±0.018a 0.309±0.025a 0.352±0.031a B组0.132±0.008 0.216±0.011 0.243±0.015 0.384±0.021 0.472±0.029 0.768±0.052 C组0.111±0.004 0.166±0.012b 0.202±0.024b 0.242±0.015b 0.303±0.022b 0.347±0.038b D组0.109±0.006 0.203±0.013 0.251±0.018 0.389±0.024 0.552±0.022 0.677±0.044

2.4 ZIC 1基因过表达对MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞药物敏感性的影响

顺铂、姜黄素、斑蝥素对A组和B组细胞的IC50比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；环磷酰胺、多西他赛、芹菜素对A组细胞的IC50均低于B组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）。顺铂、环磷酰胺、姜黄素、斑蝥素对C组和D组细胞的IC50比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；多西他赛和芹菜素对C组细胞的IC50均低于D组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 各化疗药物对各组细胞IC50的比较（µmol/L，x-± s）

3 讨论

乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤之一，也是继肺癌后女性因恶性肿瘤死亡的第二大原因。三阴性乳腺癌是指免疫组织化学染色结果雌激素受体、孕激素受体以及人表皮生长因子受体2均为阴性的乳腺癌。三阴性乳腺癌缺少靶向治疗或内分泌治疗所必需的生物标志物，化疗是最主要的治疗手段。ZIC1基因是ZIC1基因家族中的重要成员，最早在成年鼠的小脑中发现，现已被认为是潜在的抑癌基因，其在乳腺癌组织中的表达水平明显低于癌旁组织[12-13]。本研究选取MDA-MB-231和MDA-MB-468两种三阴性乳腺癌细胞株，通过慢病毒载体感染乳腺癌细胞使其稳定高表达ZIC1基因，结果发现，ZIC1过表达后，MDA-MB-231和MDAMB-468细胞的增殖能力均受到抑制，表明ZIC1基因过表达后具有抑制乳腺癌细胞生长的作用。

目前临床上治疗乳腺癌的化疗药物主要包括顺铂、环磷酰胺以及多西他赛等[14]。此外，姜黄素、斑蝥素及芹菜素作为新型的抗肿瘤中药提取物也倍受关注[15-17]。研究发现，ZIC1基因在MDA-MB-231细胞中过表达后，可增强姜黄素对乳腺癌细胞增殖的抑制作用[11]。本研究结果显示，ZIC1基因过表达对某些化疗药物具有增敏作用，ZIC1基因过表达后MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞对多西他赛和芹菜素的药物敏感性均升高，而对顺铂、姜黄素及斑蝥素的药物敏感性无明显改变，这对将来进一步研究化疗药物联合ZIC1基因转染在乳腺癌治疗中的作用具有重要的指导意义。虽然前期研究结果显示ZIC1过表达能够增强姜黄素对乳腺癌生长的抑制作用，但本研究结果显示ZIC1过表达并未使姜黄素的药物敏感性获得提高。这些研究结果提示可以从ZIC1基因联合多西他赛或芹菜素的方向深入探讨乳腺癌的治疗方法。以往研究还发现，ZIC1基因过表达后可调控蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）及细胞外调节蛋白 激 酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）信号通路，抑制消化道恶性肿瘤细胞的增殖，且可通过抑制细胞周期蛋白D1的表达，使细胞周期阻滞于G1期，并且能导致层粘连蛋白β2（laminin subunit beta 2，LAMB2）、叉头框蛋白 J1（forkhead box J1，FOXJ1）以及 SHC-转化蛋白 2（SHC adaptor protein 2，SHC2）等一系列下游调控因子异常表达[18-19]。下一步研究可通过过表达ZIC1基因联合多西他赛或芹菜素作用于三阴性乳腺癌细胞，并采用Western blot技术检测肿瘤细胞内信号通路蛋白的表达情况。后续还可进行体内试验，将转染并稳定表达ZIC1基因的三阴性乳腺癌细胞种植于裸鼠体表，对裸鼠经胃灌入多西他赛或芹菜素，观察ZIC1基因与多西他赛或芹菜素的联合应用价值。芹菜素能通过多种机制抑制肿瘤，具有天然、低毒、高效等特点，可以作为常规化疗药物的辅助用药[17]。因此，进一步研究ZIC1基因联合芹菜素的抗肿瘤作用可为化疗方案的制订提供一定的理论依据。

综上所述，乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDAMB-468中ZIC1基因过表达能有效抑制肿瘤细胞增殖，并能增强三阴性乳腺癌细胞对环磷酰胺、多西他赛及芹菜素的药物敏感性。