三种食用菌在温度胁迫下菌丝酶活性的变化研究

郭 敬，易美琴，宋 波

(西华师范大学生命科学学院，四川 南充 637000)

环境胁迫是不同的环境因子对生物所处的生存状态产生的压力，如水分亏缺、pH、高温、盐碱、环境污染等环境因子都会对生物的生长产生压力。食用菌在生长和发育的不同阶段温度、光照、含水量等环境因子的不适宜都会影响菌丝体的正常生长，最终影响食用菌的产量和品质[1]。温度是食用菌生长发育过程中最重要的影响因素，在不同的温度下食用菌产生的酶量不同，酶的活性高低也不同，这些不同是菌体适应环境的结果。在食用菌生长发育过程中，胞外酶将培养料的大分子裂解成能使菌丝和子实体利用的小分子物质，为食用菌的生长发育提供所需的营养物质，促进食用菌的生长，因此，胞外酶在食用菌的整个生长发育过程都起着非常重要的作用。当培养的温度和pH值改变时，食用菌菌丝体的胞外酶和保护酶也会产生相应变化[2-5]。

中国的食用菌菌种资源丰富,白玉菇、真姬菇、杏鲍菇是目前常见的工厂化大规模栽培食用菌。目前关于温度胁迫对食用菌酶活性影响的研究报道极少，仅限于白灵侧耳、银耳等少数食用菌的报道，对白玉菇、真姬菇、杏鲍菇尚未研究[6-7]。本研究以三种常见食用菌为实验材料探究不同温度和PH胁迫下，食用菌菌丝酶的活性变化，通过测定纤维素酶和淀粉酶两种胞外酶以及过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)两种保护酶活性的变化，以期找出在温度胁迫下三种食用菌对培养料的分解的程度以及利用率，探究食用菌菌丝酶活性的动态变化，为进一步研究食用菌的营养生理过程提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

白玉菇、杏鲍菇、真姬菇均购自南充某公司。

1.2 供试培养基

供试培养基配方：马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨3g、酵母浸膏1g、琼脂20g。

1.3 实验设备

不锈钢立式压力灭菌锅；恒温摇床THZ-92A，上海浦东物理光学仪器厂；电子天平，BS223S，Sartorius；生化培养箱；超净工作台SW-CJ-IFD，苏州净化设备有限公司；UV752N紫外可见分光广度计，上海佑科。

1.4 实验方法

1.4.1 菌种的活化 用解剖刀从经过表面消毒的白玉菇、真姬菇、杏鲍菇菌盖中部纵切一刀,切取一小块组织,移接到平板培养基上封口，置恒温培养箱内，23℃培养,数天后可见组织块上长出绒毛状菌丝，待菌丝长满平板后备用。

1.4.2 温度胁迫处理方法 先将菌丝接种于斜面固体培养基中放置于23℃(正常生理环境)培养一段时间，当菌丝长度长至培养皿的2/5时，进行温度胁迫处理。将试验组分别放置在4℃、35℃环境下培养，对照组继续于23℃下培养。在处理后的第2天开始，每隔1d,取带培养基的菌丝块,进行相关酶活的测定。

1.4.3 酶的提取胞外酶的提取参照文献[8]取菌丝培养基2g加入20mL的pH值4.8的0.1M乙酸盐缓冲溶液，23℃下250r/min下振荡浸提3h，过滤、定容至22mL，4℃、3500r/min离心10min，取上清(上清液即为粗酶液)，低温保存备用。

保护酶的提取参照文献[8]：取菌丝培养基2g加入8mL、0.05mol/L，pH值7.0的磷酸缓冲液研钵中，充分匀浆，于4℃、10000r/min离心10min，取上清(上清液即为粗酶液)，低温保存备用。

1.4.4 胞外酶的测定方法 羧甲基纤维素酶活性和淀粉酶活性的测定参照参考文献[9]略有改动。

表1 测定胞外酶活性时各试剂加入量

50℃水浴糖化30min,取出后立即于100℃水浴中煮沸15min，得糖化液，取糖化液0.5ml，加3,5-DNS显色剂1ml，在100℃水浴中显色15min，冷却后加加入蒸馏水11ml，混匀，于分光光度计550nm处比色，定义酶促生成1μg/h葡萄糖的酶量为1个酶活力单位。

1.4.5 保护酶SOD的测定方法 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用核黄素-NBT法测定[10]。

表2 测定SOD活性时各试剂加入量

SOD反应介质最后加入，4号试管加入SOD反应介质遮光处理，所有试管混合均匀后置于生化培养箱中光照显色30min(各管照光一致，反应温度24～35℃)，结束后，避光终止反应，以4号试管作空白(调零)，在560nm下测吸光度。

1.4.6 保护酶POD酶的测定方法 过氧化物酶活性(POD)采用愈创木酚法测定参照文献[10]。

取2支试管，在一支试管中加入反应混合液3mL，KH2P04lmL作为调零对照，另一支试管中加入反应混合液3mL，保护酶粗酶液1mL，反应20min后，在470nm下测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 温度胁迫对菌丝胞外酶的影响

2.1.1 温度胁迫下CMC酶活性的变化趋势 如图1所示经过35℃高温处理之后24h后参考对照组

图1 温度胁迫下三种供试菌种CMC酶活性的变化趋势

(23℃)变化，高温胁迫时，杏鲍菇CMC酶活性在开始阶段快速下降，到第4天时酶活性仅为初始活性的54%，之后趋于稳定；低温胁迫时，CMC酶活性先升高，第4天达到最大值酶活性为初始活性的1.35倍，之后快速下降。而真姬菇在高温胁迫下CMC酶活性在起初逐渐升高，第4天的酶活性约为第2天的1.3倍，之后迅速下降，在胁迫第6天时酶活性下降50%；而在低温胁迫下，真姬菇CMC酶活性一直处于下降趋势，第2天到第4天下降趋势较为缓慢，第6天的酶活性仅为第2天的43%。整体上，真姬菇菌丝处于高温时，CMC酶活性都要低于正常温度；处于低温时，CMC酶活性都要高于正常温度。与杏鲍菇和真姬菇都不同，参考对照组(23℃)变化，温度过高时，白玉菇菌丝CMC酶活性增加幅度相当明显，在第4天达到最大值酶活性上升2.28倍，然后开始下降；而在温度过低时，白玉菇菌丝CMC酶活性呈先下降后上升的趋势，但变化幅度较小。

2.1.2 温度胁迫下淀粉酶变化趋势 如图2所示在温度胁迫下，杏鲍菇淀粉酶活性皆先降低，在第4

图2 温度胁迫下淀粉酶活性的变化趋势

天降到最小值，然后升高。整体上，高温胁迫下杏鲍菇菌丝淀粉酶活性比正常温度低而低温胁迫下，淀粉酶活性高于低于正常温度。而真姬菇淀粉酶活性在高温胁迫下起初升高，在第4天酶活性约为第2天的1.4倍，之后迅速下降，在胁迫第6天时接近于零；而在低温胁迫下，真姬菇淀粉酶活性一直下降趋势，最后趋近于零。而白玉菇淀粉酶活性先下降，在第4天到最小值，酶活性约为第2天的0.5倍之后呈上升趋势态；不同于杏鲍菇的是，整体上，白玉菇菌丝处于高温时，淀粉酶活性都要低于正常温度；处于低温时，淀粉酶活性与正常温度相当。

由此可以看出不同温度差异下，3种食用菌的胞外酶活性变化较为明显。测定结果表明，杏鲍菇在高温胁迫下，CMC酶活性下降，而真姬菇和白玉菇酶活性先升高后降低；而在低温胁迫下，杏鲍菇CMC酶活性先升高后降低，真姬菇酶活性持续下降，白玉菇酶活性先降低后升高。而在受到温度胁迫时，3种食用菌的淀粉酶活性都急剧变化，杏鲍菇与白玉菇变化趋势相近，在高温和低温胁迫下，淀粉酶活性都先降低后升高，而真姬菇在低温胁迫下酶活性持续下降，在高温胁迫下酶活性先上升后下降。说明3种食用菌的菌丝胞外酶对温度胁迫比较敏感。

2.2 温度胁迫对菌丝保护酶的影响

2.2.1 温度胁迫下SOD活性的变化趋势

图3 温度胁迫下SOD活性的变化趋势

如图3：温度变化引起杏鲍菇SOD活性升高，在高温胁迫下，杏鲍菇菌丝酶活在第4天迅速增加约3.5倍达到最大值，之后迅速下降；而在低温胁迫下，杏鲍菇菌丝SOD活性一直升高。与杏鲍菇不同，高温使真姬菇活性先升高，在第4天后快速下降；而低温使真姬菇活性缓慢下降，最后略高于对照组SOD活性。与真姬菇SOD变化大致相同，高温胁迫使白玉菇菌丝活性先升高，在第4天后急剧下降；而不同的是，低温下白玉菇活性缓慢下降，趋势与对照组近似平行。

2.2.2 温度胁迫下POD活性的变化趋势

图4 温度胁迫下POD活性的变化趋势

如图4：参考对照组(23℃)变化，温度过高时，杏鲍菇菌丝POD活性开始阶段呈下降趋势；而温度过低时，杏鲍菇POD活性持续升高，后期生长阶段中升幅不大。与杏鲍菇不同，与对照组相比，高温胁迫下，真姬菇POD活性趋于稳定状态，但要低于正常温度时的POD活性；低温胁迫下，真姬菇POD活性起初升高，第4天达到最大值，然后开始降低，最后趋近于零。

与杏鲍菇和真姬菇不同，在高温胁迫下，白玉菇POD活性起初呈上升状态，第4天达到最大值，然后开始下降，最后趋近于零；而在低温胁迫下，白玉菇菌丝POD活性呈稳定升高趋势。

3 讨论

3.1 胞外酶与食用菌逆境生长的关系

食用菌是一类没有叶绿素的异养型真核生物，其主要依靠产生多种胞外酶来分解营养物质，以维持其生命活动，完成生活史。由此可见，胞外酶的活性高低决定食用菌对营养物质的分解程度和效率，影响着其对营养成分的吸收和利用率，也间接影响着食用菌的产量和品质[11]。通过实测定结果得出：在食用菌菌丝生长阶段，胞外酶活性在受到温度胁迫时，酶活性有一定影响，在低温环境下影响效果不大；胞外酶活性变化与环境有关，但环境不是决定性因素，主要起决定性作用的是食用菌的种性，即不同菌种在不同环境下，胞外酶的活性变化差异显著，这主要是受遗传因素的影响。

3.2 保护酶与食用菌逆境生长的关系