芒柄花黄素对阿尔茨海默病小鼠血脑屏障通透性和海马闭锁小带蛋白-1表达的影响

张英博 费洪新

(1齐齐哈尔医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2新余学院)

阿尔茨海默病(AD)是一种老年性、神经性、退行性和进行性的中枢神经系统常见疾病之一，其发病率随着人口老龄化而增加，可采用多奈哌齐进行治疗〔1〕。AD发生发展与血脑屏障(BBB)通透性增加有关〔2,3〕，维持BBB的基本结构包括血管内皮细胞、星形胶质细胞及周细胞，其中血管内皮细胞表面表达的闭锁小带蛋白(ZO)-1是血管内皮细胞紧密连接(TJ)的主要结构〔4,5〕。芒柄花黄素(FMN)具有调控BBB血管内皮细胞晚期糖基化终末产物受体(RAGE)表达、上调血管内皮生长因子(VEGF)和促进碱性成纤维细胞生长因子分泌等功能〔6,7〕。本研究探讨FMN对AD小鼠BBB通透性和海马ZO-1表达的影响机制。

1 材料和方法

1.1实验动物 健康2月龄清洁级雄性昆明小鼠56只，体质量(22±2)g，购于黑龙江中医药大学〔SCXK(黑)2013-012〕，常规饲养、给药及给水。

1.2主要试剂 FMN(成都曼思特生物公司，16031005)；多奈哌齐(重庆植恩药业有限公司，20141201)；β-actin(Santa Cruz Biotechnology公司，sc47778)；ZO-1(北京博奥公司，bs1329)；Aβ1～42、D-半乳糖(Sigma公司)；RNeasy@ Mini Kit(QIAGEN公司)，其他试剂由齐齐哈尔医学院超微病理实验中心提供。

1.3主要仪器 TGL-16G型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；STW-1型脑立体定位仪(成都仪器厂)；7300型实时荧光定量仪(美国ABI 公司)；HMIAS型彩色分析系统(武汉千屏有限公司)；6100型RT-雷杜酶标仪(美国RT公司)；-80℃冰箱(日本SANYO公司)；超净操作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)等。

1.4动物模型制备、实验分组及治疗方法 昆明小鼠56只按照随机数字表分出8只为对照组，余下48只制备AD小鼠模型。参考文献〔8，9〕方法，小鼠麻醉后去除头毛发后固定，定位海马，双侧脑室连续注入10 μg Aβ1～42(终浓度为2 mg/ml)，留针10 min，包扎，腹腔注射D-半乳糖(终浓度为180 mg/kg)。8只造模失败，将造模成功40只AD模型小鼠按照随机数字表分模型组、多奈哌齐组、FMN高、中、低剂量组。多奈哌齐组给予多奈哌齐(1 mg/kg)灌胃；FMN高、中、低剂量组分别给予FMN 30.0、15.0、7.5 mg/kg灌胃；对照组、模型组给予生理盐水灌胃，连续灌胃35 d。

1.5测定BBB通透性 参考文献〔10〕方法，用脑伊文思蓝(EB)含量表示BBB通透性。小鼠灌胃结束后尾静脉注射EB(2%)，麻醉后左心室灌注生理盐水70 ml冲洗，冰台上取脑并记录脑湿重，52℃恒温烘烤72 h后记录脑干重。将脑放于甲酰胺溶液中浸泡，45℃避光孵育72 h后匀浆，3 000 r/min离心10 min。在酶标仪上630 nm处测定上清液吸光度值(A)并计算EB含量。脑含水量=〔(脑湿重-脑干重)/脑湿重〕×100%。EB含量=EB浓度/脑湿重(μg/g)。

1.6检测海马ZO-1表达 昆明小鼠灌胃给药结束后，对小鼠进行心脏灌注甲醛，按照免疫组化试剂盒说明书进行操作，包括制备脑石蜡切片、脱蜡、过氧化物酶处理、封闭、滴加抗体、显色、复染、透明、封片等基本步骤，采用HMIAS型彩色分析系统计算分析海马积分光密度值。

1.7检测海马ZO-1基因表达 昆明小鼠灌胃给药结束后处死小鼠，取材小鼠海马，按照Trizol试剂盒方法提取海马总RNA，合成cDNA后聚合酶链反应(PCR)扩增。设计β-actin、ZO-1 mRNA引物：β-actin上游 5′-CGT GCG TGA CAT CAA AGA GAA-3′，下游 5′-AAC CGC TCG TTG CCA ATA GT-3′；ZO-1上游5′-GTA ACC ATT TTT GGA CCA ATA GCT G-3′，下游5′-GCC AGA GCT ACG TTG GTC AGT T-3′，引物由上海生物工程公司合成。将反应体系配置成50 μl，50℃反应15 min，95℃反应15 min，94℃反应15 s，55℃反应45 s，40个循环，iQTM5软件分析PCR样本Ct值，按照公式(2-△△Ct法)计算ZO-1相对表达量。

1.8检测海马ZO-1表达 昆明小鼠灌胃给药结束后，对小鼠进行心脏灌注生理盐水后处死小鼠，取材小鼠海马，将海马裂解并测定蛋白浓度。蛋白经过100℃变性5 min、分离、转膜、封闭、加一抗、加二抗、显色、曝光等基本步骤，采用HMIAS型彩色分析系统，以目的蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值计算ZO-1相对表达强度。

1.9统计分析 采用SPSS19.0软件单因素方差分析和t检验。

2 结 果

2.1BBB通透性 相较于对照组，模型组脑含水量、脑EB含量明显增加(P<0.05)；相较于模型组，FMN高、中剂量组和多奈哌齐组脑含水量、脑EB含量明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组BBB通透性比较

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；下表同

2.2海马ZO-1表达 与对照组比较，模型组海马ZO-1积分光密度值、mRNA相对表达量、蛋白相对表达强度明显降低(P<0.05)；与模型组比较，FMN高、中剂量组和多奈哌齐组海马ZO-1积分光密度值、mRNA相对表达量、蛋白相对表达强度明显升高(P<0.05)，而FMN低剂量组海马ZO-1积分光密度值、mRNA相对表达量、蛋白相对表达强度改变不明显(P>0.05)。见表2。

表2 各组海马ZO-1表达

3 讨 论

AD发病机制极其复杂，可伴有BBB血管内皮细胞结构异常而出现通透性增加和脑水肿，本实验结果提示FMN高、中剂量可改善BBB血管内皮细胞结构，降低BBB通透性，减少部分水分进入脑内，减轻脑水肿，小鼠海马血管内皮细胞BBB通透性升高时伴有海马紧密连接关键蛋白ZO-1表达降低，而小鼠海马血管内皮细胞BBB通透性降低时伴有海马紧密连接关键蛋白ZO-1表达升高，本文结果表明，FMN高、中剂量可改善AD小鼠BBB通透性，这与降低ZO-1表达有一定关系。

综上，FMN通过抑制海马ZO-1表达来改善AD小鼠BBB通透性，这为FMN通过ZO-1信号通路来防治AD奠定了基础。