程氏蠲痹汤对类风湿关节炎SD大鼠血清白细胞介素-17和-35水平的影响

雷长国 覃建锋 梁子聪 王恒 余跃生 蔡林

(1黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558013；2川北医学院附属医院中医科)

程氏蠲痹汤是清代名医程钟龄创制的经典方，常用于治疗类风湿关节炎一类痹证，临床疗效显著〔1〕，本研究在许霞等〔2～4〕研究基础上，进一步探求该方发挥临床疗效的内在机制，为临床精准用药提供依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康成年SD大鼠，均为雄性，体质量(220±15)g，购自重庆腾鑫生物技术有限公司，许可证号SCXK(渝)2017-007(SPF级)。提前1 w购入大鼠，动物房适应性饲养，饲养温度(19±2)℃，相对湿度30%～35%，动物房系高清洁级，通风良好、自然光照，符合《实验动物环境及设施》要求。

1.2实验药品、试剂及仪器 程氏蠲痹汤组方为羌活3 g、独活3 g、秦艽3 g、桂心1.5 g、当归9 g、川芎2.1 g、桑枝9 g、海风藤6 g、木香2.4 g、乳香2.4 g、炙甘草1.5 g，常规煎煮制备后浓缩，浓度调整为0.3 g生药/ml,滤过除菌，-4℃冷藏备用，由黔南民族医学高等专科学校第二附属医院中药房制剂室提供。雷公藤多苷片10 mg×50片(批号：20170302)，由湖南千金协力药业有限公司提供。完全弗氏佐剂10 ml/支(批号：201711)，购自贵州鼎国生物技术有限责任公司。大鼠白细胞介素(IL)-17、IL-35酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(批号分别为201711、201712)，均由南京建成生物工程研究所提供。全自动酶标仪(系列号：WH-37104623，迈瑞公司)。电子天平(规格：KHL-520 g/0.1 g,北京朗科兴业称重设备有限公司)。

1.3模型制作 除正常组注射等量生理盐水外，其余大鼠左后足底常规消毒后，足跖皮内注射完全弗氏佐剂每只100 μl，并每日数次对大鼠四肢吹凉风、泡冷水，1 w后于大鼠尾根部皮内注射完全弗氏佐剂每只100 μl以加强，继续对大鼠四肢吹凉风、泡冷水，再1 w后对侧脚关节肿胀、功能受限，免疫应答形成，建立类风湿关节炎动物模型。

1.4分组处理 除正常组外，其余随机分为模型组、程氏蠲痹汤高剂量组、低剂量组、雷公藤多苷片组，每组8只，共5组。正常组及模型组均用普通饲料喂养，3个治疗组分别在用普通饲料喂养前以相应药物灌服治疗，程氏蠲痹汤高剂量组以7.10 g/kg灌服、1次/d,程氏蠲痹汤低剂量组以1.78 g/kg灌服、1次/d，雷公藤多苷片组以6 mg/kg灌服、1次/d，连续喂养、用药3 w。

1.5标本留取 各组分别于第1、2、3周末灌服药物后2 h切开股动脉取血5 ml/只，5℃以下静置6 h,取上清液封装置于冷冻箱-40℃待测；取血同时留取各组肝、肾、脾、四肢关节以4%甲醛液固定待病检。

1.6指标检测 IL-17和IL-35均采用ELISA双抗体夹心法，严格按照试剂盒要求测定。将各固定组织进行脱钙、脱水、透明、石蜡包埋、切片、贴片、染色、封片，用显微镜观察。

1.7统计方法 采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析，均数多重比较在满足方差齐性时采用LSD法及Duncan法，相关性采用Pearson相关系数分析。

2 结 果

2.1各组血清IL-35含量变化 治疗第7天，与正常组比较，模型组IL-35含量显著降低(P<0.01)，3个治疗组与模型组比较差异不明显(P>0.05)；治疗第14天，程氏蠲痹汤高剂量组与雷公藤多苷片组差异明显(P<0.05),程氏蠲痹汤高剂量组与正常组无明显差异(P>0.05)，雷公藤多苷片组与正常组仍差异明显(P<0.05)，程氏蠲痹汤低剂量组与模型组无明显差异(P>0.05)；治疗第21天，程氏蠲痹汤高剂量组、雷公藤多苷片组、正常组两两比较无明显差异(P>0.05)，程氏蠲痹汤低剂量组与模型组差异不明显(P>0.05)。见表1。

2.2各组血清中IL-17含量变化 治疗第7天，模型组IL-17含量比正常组明显增多(P<0.01)，3个治疗组与模型组无显著差异(P>0.05)；治疗第14天，程氏蠲痹汤高剂量组、雷公藤多苷片组比模型组明显降低(P<0.05),程氏蠲痹汤高剂量组与正常组差别不明显(P>0.05),雷公藤多苷片组比正常组仍明显偏高(P<0.05)；治疗第21天，程氏蠲痹汤高剂量组、雷公藤多苷片组与正常组均无明显差异(P>0.05)，程氏蠲痹汤低剂量组与模型组无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组治疗后各时间点血清IL-35、IL-17含量

与正常组比较：1)P<0.05；与雷公藤多苷片组比较：2)P<0.05；与模型组比较：3)P<0.05

2.3程氏蠲痹汤高剂量组检测指标的相关性 IL-35、IL-17含量随治疗时间推移呈负相关(r=-0.756，P=0.019)。

2.4各组踝关节病检结果 模型组踝关节滑膜组织增生、水肿，血管翳形成，滑膜组织内小血管增生，扩张充血，大量炎细胞浸润，以淋巴细胞、单核巨噬细胞和浆细胞，慢性炎细胞浸润为主，伴大量肉芽肿形成。正常组踝关节滑膜组织光滑，滑膜细胞单层排列，无组织水平、增生，无炎症细胞浸润。见图1。程氏蠲痹汤低剂量组滑膜组织增生、水肿，血管翳形成，滑膜组织内小血管增生，扩张充血，大量炎细胞浸润，以淋巴细胞、单核巨噬细胞和浆细胞，慢性炎细胞浸润为主，伴大量肉芽肿形成；与模型组无明显差异。程氏蠲痹汤高剂量组滑膜组织增生、水肿情况有所减轻，可见滑膜组织内小血管增生，扩张充血，大量炎细胞浸润，以淋巴细胞、单核巨噬细胞和浆细胞，慢性炎细胞浸润为主，肉芽肿有所减少；与雷公藤多苷片组治疗第7天无明显差异。治疗第14、21天周围炎症细胞减少，肉芽肿数量减少。雷公藤多苷片组治疗第7天滑膜组织增生、水肿情况减轻，但仍见滑膜组织内小血管增生，扩张充血，大量炎细胞浸润，以淋巴细胞、单核巨噬细胞和浆细胞，慢性炎细胞浸润为主，肉芽肿减少；治疗第14天滑膜组织内小血管增生、扩张充血情况减轻，炎症细胞减少；治疗第21天炎症细胞减少，肉芽肿数量减少。见图2，图3。5组肝肾病检无差异，说明用程氏蠲痹汤和雷公藤多苷片在较短时间内治疗无肝肾毒性，较安全。

图1 模型组与正常组踝关节病理(HE，×100)

治疗第7天

治疗第14天

治疗第21天

治疗第7天程氏蠲痹汤低剂量组

治疗第4天程氏蠲痹汤低剂量组

治疗第21天程氏蠲痹汤低剂量组

治疗第7天雷公藤多苷片组

治疗第14天雷公藤多苷片组

治疗第21天雷公藤多苷片组

3 讨 论

IL-17和IL-35是近年发现的细胞因子家族中的新成员，IL-17是Th17细胞主要效应因子，IL-17是T细胞诱导的炎症反应的早期启动因子，可以通过促进释放前炎性细胞因子来放大炎症反应，Th17细胞产生的IL-17能有效地介导中性粒细胞动员的兴奋过程，从而有效介导组织的炎症反应，IL-17是一种强有力的促炎因子，而IL-35能明显抑制Th17细胞分化和IL-17合成〔5〕，IL-35能降低IL-17水平，IL-35已成为类风湿关节炎治疗新靶点〔6〕。

类风湿关节炎大鼠血清中细胞因子IL-35水平明显减少，而IL-17表达明显增多，提示在大鼠关节炎形成中IL-17是重要的致炎因子〔7～10〕，IL-35的抑炎作用明显减弱〔11，12〕，本研究以程氏蠲痹汤的配伍比例，适当增大剂量，疗效是确切的，甚至比常用药雷公藤多苷片更快达到最佳疗效。提示在临床中，程氏蠲痹汤用药须持续至2 w以上并适当保持，而雷公藤多苷片用药须持续3 w以上并适当保持。

本实验周期较短。临床中为进一步减轻症状、巩固疗效，用药常会适当持续，为降低机体的药物耐受性及可能的药物副作用，可将程氏蠲痹汤、雷公藤多苷片或其他已证明对治疗类风湿关节炎可靠的药物交替使用。

程氏蠲痹汤方中的独活、羌活、秦艽、海风藤祛风散寒除湿，木香、桂心、桑枝疏通经络，再佐以乳香、川芎、当归活血化瘀，共用能祛散外邪、疏通筋脉、复行气血，自然对风寒湿痹证有良效。

本研究对类风湿关节炎用药的时间节点和剂量的精准把握方面作了一定的探求，为中医经典方剂发掘利用及内在机制阐明提供一定参考。

本研究存在实验周期短、样本较少、检测指标较少及模型制作与临床患者实际致病存在差异等诸多局限，以后的研究中应增大样本数、模拟临床的病患周期、考察更多的可能干扰因素，把经典方程氏蠲痹汤的临床及实验研究引向深入。