不同企业雷公藤多苷片的制剂质量比较与评价△

汪祺，王亚丹，郑笑为，文海若，马双成

中国食品药品检定研究院，北京 100050

雷公藤为卫矛科雷公藤属植物，药用部位多为其干燥根[1]。其具有祛风除湿、活血通络、杀虫解毒等功效，临床应用范围较广，适应症包括类风湿性关节炎、银屑病、红斑狼疮及器官移植后作为免疫抑制剂使用[2-5]。雷公藤主要化学成分包括萜类，其中对二萜成分雷公藤甲素和三萜成分雷公藤红素药理研究较多，其被认为是雷公藤的主要药效成分；此外，雷公藤还含有倍半萜生物碱、倍半萜多醇酯及木脂素等[6-13]。随着雷公藤制剂的广泛使用，其临床不良反应及毒性逐渐凸显，主要表现为肝、肾毒性、血液系统及生殖系统损害。有研究显示，雷公藤甲素及雷公藤红素为其主要药效及毒性成分[14-15]。有研究针对不同厂家雷公藤多苷片制剂进行了指纹图谱及小鼠体内抗炎药效、毒性比较研究，结果发现，7个厂家的雷公藤多苷片化学成分差异显著，同时抗炎药效及肝肾毒性方面也存在较大差异。因此控制制剂质量，使其发挥药效的同时避免不良反应发生成为雷公藤制剂质控亟待解决的问题[16]。

本研究依托国家药品评价抽验工作，对全部雷公藤多苷片现行生产企业进行抽样测定，共涉及10个企业171批次样品，实验采取标准检验与探索性研究相结合的方法，首先对雷公藤多苷片质量进行整体评价，并发现该品种存在的问题；其次进行体外毒性实验，对制剂中含量较高的单体成分进行肝毒性考察，旨在为进一步完善该制剂安全性标准提供数据支持。

1 材料

1.1 仪器

Waters 2695-2996 PDA型液相色谱系统；薄层色谱自动点样仪(卡玛公司)；ZBS-6E型智能崩解试验仪(天津市精拓仪器科技有限公司)；VICTOR X5型多功能酶标仪(PerkinElmer)。

1.2 试药

雷公藤甲素对照品(批号：111567-201404，纯度：99.8%)、雷公藤红素对照品(批号：111946-201501，纯度：97.0%)、雷公藤内酯甲对照品(批号：111597-200505，纯度：100%)购自中国食品药品检定研究院；对琨B(纯度>98%)为中国医学科学院北京协和医学院药物研究所赠送；雷公藤次碱(批号：PL0078，纯度≥98.5%)、雷公藤春碱(批号：PL0077，纯度≥98.5%)、雷公藤晋碱(批号：PL0080，纯度≥99%)购自成都普利斯生物科技有限公司；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，Sigma)；RPMI 1640培养基(Hyclone)；1%青链霉素混合液(南京凯基生物科技发展有限公司)；胰蛋白酶-EDTA消化液(Life Technologies)；胎牛血清(FBS,Gibco)；细胞增殖-毒性检测试剂盒/CCK-8(日本同仁化学研究所)；中性氧化铝(Agela Technologies，200目)；雷公藤多苷片(来自10个企业共171批次，企业分别用A～J代表)；乙酸乙酯(分析纯，北京化学试剂厂)；乙腈、甲醇均为色谱纯(Fisher公司)。

2 方法

2.1 崩解时限考察

按《中华人民共和国药典》2015年版一部附录Ⅻ A 崩解时限检查法测定171批次雷公藤多苷片崩解时间，标准规定供试品应在1 h内全部崩解。

2.2 薄层鉴别

参照国家药品监督管理局颁标准(WS3-B-3350-98-2011)项下雷公藤内酯甲薄层检查，制备质量浓度为1 mg·mL-1的雷公藤内酯甲对照品溶液。供试品溶液制备方法详见标准。以环己烷-丙酮(5∶3)为展开剂展开，10%硫酸乙醇溶液显色，105 ℃加热至斑点显色清晰[17]。

2.3 雷公藤甲素检查

取雷公藤甲素适量，精密称定，加甲醇制成0.05 mg·mL-1的对照品溶液；供试品溶液同[雷公藤内酯甲含量测定]项下供试品溶液制备方法，分别精密吸取对照品及供试品溶液各10 μL测定，以甲醇-水(43∶57)为流动相，检测波长为218 nm[17]。

2.4 雷公藤内酯甲含量测定

参照国家药品监督管理局颁标准(WS3-B-3350-98-2011)项下雷公藤内酯甲含量测定项，取雷公藤内酯甲适量，甲醇溶解配制每1 mL含0.1 mg的对照品溶液；供试品溶液制备方法：雷公藤多苷片乙酸乙酯提取后经中性氧化铝处理，收集洗脱液，最终定容至5 mL量瓶。取对照品及供试品溶液各10 μL测定，以甲醇-乙腈-水(64∶16∶20)为流动相，检测波长为210 nm[17]。

2.5 体外肝细胞毒性研究

将HepaRG细胞接种于75 mL培养瓶内，以RPMI 1640完全培养基(含10%FBS和1%青链霉素混合液)于37 ℃、5%CO2的培养箱内培养。培养基隔天更换，细胞贴壁生长，覆盖瓶底80%～90%时，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，并调整细胞密度为1×105个/mL。在96孔板中接种细胞悬液，每孔100 μL，置于培养箱内培养，待细胞贴壁后更换含不同浓度药物的培养液。雷公藤甲素、雷公藤内酯甲给药浓度分别为5、10、20、40、80、160、320 nmol·L-1，雷公藤红素给药浓度分别为0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6 μmol·L-1，对琨B给药浓度分别为2.5、5、10、20、40、80、160 μmol·L-1，雷公藤春碱、雷公藤次碱、雷公藤晋碱给药浓度均分别为5、10、20、40、80、160、320 μmol·L-1，每个浓度设3个复孔，同时设0.5%DMSO作为溶媒对照，设不含细胞的培养基作为空白对照。给药后在培养箱内孵育24 h，向每孔加入10 μL CCK-8溶液后在培养箱内孵育1～4 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值并计算细胞存活率。

(1)

3 结果

3.1 崩解时限检查结果

按标准检验所有样品崩解时限(1 h)均符合规定，但不同企业间崩解时间差异显著，部分企业样品崩解时间不足1 min，而导致崩解时间差异显著的主要原因为制剂工艺不统一。结果见表1。

表1 10个不同企业来源的雷公藤多苷片的崩解时间

3.2 薄层鉴别检查结果

按标准进行薄层检查(见图1)，171批次样品均可检出雷公藤内酯甲相对应斑点，但现行标准中对照品配制浓度与样品中雷公藤内酯甲实际含量相差较大，建议调整该标准中对照品使用浓度。

注：1～8、10～20.10个企业中随机抽取样品各1个批次；9.雷公藤内酯甲对照品。图1 雷公藤多苷片薄层鉴别

3.3 雷公藤甲素检查结果

10个企业随机抽取1个批次样品进行测定，结果见图2。液相色谱图显示，不同企业间雷公藤多苷片所含化学成分存在明显差异；此外通过对171批次样品测定发现(见表2、图2)，虽然10个企业雷公藤甲素含量均符合标准规定，每片含雷公藤甲素不超过10 μg，但不同企业及相同企业不同批次间，雷公藤甲素含量差异显著，部分企业甚至未检出雷公藤甲素。提示，作为已被证明为药效成分的雷公藤甲素除规定上限外，同时应对含量下限进行明确规定。

注：10个企业随机取1批进行测定。图2 雷公藤多苷片中雷公藤甲素液相色谱图

表2 10个不同企业来源的雷公藤多苷片中的雷公藤甲素含量

3.4 雷公藤内酯甲含量测定结果

10个企业随机抽取1批次样品进行测定，结果见图3、表3。液相色谱图显示，不同企业间雷公藤多苷片所含成分存在明显差异。通过对171批次样品测定发现，10个企业雷公藤内酯甲含量均符合标准规定，每片含雷公藤内酯甲不少于10 μg，然而不同企业间，雷公藤内酯甲含量11～62 μg/片，同一企业不同批次间含量19～62 μg/片，可见质控指标雷公藤内酯甲含量波动范围大，存在产品质量整体不稳定的情况。

注：10个企业随机取1批进行测定。图3 雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲液相色谱图

表3 10个企业雷公藤多苷片中雷公藤内酯甲含量情况

3.5 体外细胞毒性评价

雷公藤多苷片现行标准控制的指标成分主要为雷公藤内酯甲及雷公藤甲素，10个企业171批次样品中雷公藤内酯甲含量范围分布差异较大，而已有明确毒性报道的雷公藤甲素在制剂中含量普遍较低，部分企业甚至不含雷公藤甲素，因此提示雷公藤多苷片不良反应的原因是否为其他成分导致。查阅文献发现，雷公藤多苷片中雷公藤红素也具有药效作用且含量较高，此外生物碱类成分约占其总提取物的30%，而此类成分以往研究较少，因此针对这一类含量高或具有药效作用的成分进行体外细胞毒性考察，可初步推测其潜在毒性风险，为形成制剂质量标准提供数据支持。实验选取雷公藤甲素、雷公藤内酯甲、雷公藤红素、对琨B及具有结构代表性的生物碱雷公藤春碱、雷公藤次碱、雷公藤晋碱进行体外毒性考察。

实验结果以细胞存活率及半数抑制浓度(IC50)值为评价指标，考察待测单体的潜在毒性作用，结果见图4、表4。分析数据发现，雷公藤甲素(IC50为0.015 μmol·L-1)及对琨B(IC50为0.10 μmol·L-1)毒性强，雷公藤红素(IC50为5.73 μmol·L-1)次之，4个生物碱单体成分几乎没有毒性作用，因此提示，除雷公藤甲素外，应增加制剂中对琨B及雷公藤红素的含量限度控制。相反，生物碱类成分含量高，无明显毒性作用，因此其是否具有药效作用值得进一步研究。

注：a.雷公藤甲素；b.雷公藤红素；c.雷公藤内酯甲；d.雷公藤春碱；e.雷公藤次碱；f.雷公藤晋碱；g.对琨B。图4 雷公藤药材不同单体体外细胞毒性实验

表4 雷公藤药材中不同单体的体外细胞毒性结果 μmol·L-1

4 讨论与结论

本研究发现，雷公藤多苷片制剂不同企业及相同企业不同批次间样品崩解时限差异大，雷公藤甲素及雷公藤内酯甲含量相差悬殊，雷公藤内酯甲含量测定结果显示，该成分含量11～62 μg/片，提示该产品整体质量不稳定。

目前，雷公藤多苷片制剂原料均由制剂厂家自行制备，无统一生产工艺，制备雷公藤总苷涉及柱层析环节，而吸附剂用量、洗脱溶剂、组分收集等方面各企业不尽相同，由此导致制剂崩解时间相差悬殊，化学成分含量相差较大，在临床上则表现为疗效和毒副作用的差异。现代药理研究表明，不同生产企业雷公藤多苷片制剂在抗炎药效方面不同[16]。此外，6个不同企业雷公藤多苷片小鼠肝毒性研究发现，不同企业生产的雷公藤多苷片，对于小鼠肝系数、血清生化及肝组织中丙二醛(MDA)值影响作用差异显著，提示质量差异与其临床不良反应也具有明显相关性[18]。因此控制制剂质量，使其发挥药效的同时避免不良反应发生成为雷公藤制剂质控亟待解决的问题。提高雷公藤多苷片制剂质量，首先要统一该制剂生产工艺，其次建立合理的质量标准。本研究发现，雷公藤多苷片现行标准存在如下问题：薄层鉴别与含量测定项重复设定，且薄层鉴别对照品溶液浓度与制剂中雷公藤内酯甲含量差异大，不利于实验结果判定；雷公藤甲素含量检查仅设置上限，而部分企业样品未检出该成分，因此建议增加下限检查。其次，针对其不良反应的发生，本研究体外毒性实验发现，对琨B及雷公藤红素为潜在毒性成分，含量较高的生物碱可能为一类毒性低同时具有药效的活性成分，因此建议进一步考察其药效并增设控制指标。