天芪益智颗粒对Aβ1-42诱导的阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力及蛋白质组的影响

刘美琪 卫东锋 马涛 任建廷

摘要：目的  觀察天芪益智颗粒对阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）大鼠学习记忆能力和皮层、海马组织蛋白质组的影响，探讨其分子作用机制。方法  将实验大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性药组和天芪益智颗粒高、中、低剂量组，每组12只。灌胃给药，每日1次，连续40 d。给药结束后，采用Morris水迷宫实验评价大鼠学习记忆能力，应用TMT蛋白质组学方法进行质谱分析，确定天芪益智颗粒组与模型组间的差异蛋白质，应用PANTHER及STRING软件对差异蛋白进行生物信息学分析，采用Western blot对苹果酸脱氢酶和Fas相关的死亡结构域蛋白的表达变化进行验证。结果  水迷宫实验结果显示，与模型组比较，天芪益智颗粒高、中剂量组定位巡航实验中逃避潜伏期缩短，空间探索实验中穿越目标区域次数显著增加（P<0.05，P<0.01）;蛋白质组学结果显示，天芪益智颗粒高剂量组中成功鉴定33个差异蛋白质，这些蛋白及网络的功能涉及能量代谢、神经传递、细胞凋亡、细胞骨架、神经营养等，且Western blot蛋白表达检测结果与蛋白质组学结果一致。结论  天芪益智颗粒可明显改善AD大鼠学习记忆能力，其机制与调节能量代谢、神经传递、细胞凋亡、细胞骨架及神经营养蛋白的表达密切相关。

关键词：天芪益智颗粒;阿尔茨海默病;学习记忆能力;蛋白质组学;能量代谢;大鼠

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）06-0042-09

Abstract： Objective To observe the effects of Tianqi Yizhi Granules on learning and memory ability and proteomics in cerebral cortex and hippocampus of AD rats; To explore the molecular mechanism of Tianqi Yizhi Granules. Methods SD rats were randomly divided into sham-operation group， model group， Tianqi Yizhi Granules high-， medium-， and low-dosage groups， with 12 rats in each group. The rats received gavage for medication， once a day for 40 d. After the end of the administration， Morris water maze test was used to evaluate the effects of medicine on the learning and memory ability of the rats. The TMT proteomics method was used for mass spectrometry todetermine the differential proteins between Tianqi Yizhi Granules groups and model group. Bioinformatics analysis of differential proteins was performed by using PANTHER and STRING software， and the expression changes of malate dehydrogenase and Fas-associated death domain protein were verified by Western blot. Results Morris water maze experiment showed that the escape latency of Tianqi Yizhi Granules high- and medium-dosage groups were shortened and the times of crossing target quadrant in space exploration experiment significantly increased （P<0.05， P<0.01） compared with model group. Proteomics results showed that there were 33 differentially expressed proteins between model and Tianqi Yizhi Granules groups. The functions of these proteins and protein network were related to energy metabolism， neurotransmission， cell apoptosis， cytoskeleton and neurotrophy. The Western blot results of malate dehydrogenase and FAS-associated death domain protein were consistent with proteomics results. Conclusion Tianqi Yizhi Granules can improve learning and memory ability of AD rats and the action of mechanism is closely related to the regulation of protein expression of energy metabolism， neurotransmission， apoptosis， cytoskeleton and neurotrophin.

Keywords： Tianqi Yizhi Granules; Alzheimer disease; learning and memory ability; proteomics; energy metabolism; rats

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种神经退行性疾病，以记忆障碍、失用、失认、视空间损害、执行功能障碍及人格、行为异常为主要临床表现，主要病理表现包括脑萎缩、β-淀粉样蛋白（beta-amyloid protein，Aβ）沉积、神经原纤维缠结、神经元及突触丢失[1]。2000-2013年，AD死亡人数增加71%[2]，目前全球已有4680万人患有AD，预计到2050年将增加到1.315亿[3]，AD防治的全球成本已占全球GDP的0.65%[4]。因此，寻找抗AD新药，减轻患者医疗和家庭负担是目前迫切需要解决的问题之一。Aβ级联反应和Tau蛋白磷酸化是AD主要病理表现[5]，Aβ是AD生物标志物之一，可引发一系列氧化应激及炎症反应，最终导致神经元死亡[6-7]。

临床上目前使用的抗AD药物大多针对AD某一病理环节起作用，不良反应大、费用昂贵，而中医药在防治AD方面积累了丰富的临床经验，具有一定的潜在优势和研发价值[8-10]。天芪益智颗粒由红景天提取物和红芪提取物组成，主要有效成分为红景天苷和红芪多糖，二者均有一定的神经保护和抗氧化作用。本研究采用Aβ1-42脑内注射法建立AD大鼠模型，应用Morris水迷宫实验评价天芪益智颗粒的认知改善作用，采用TMT蛋白质组学方法分析药物影响的差异蛋白质，采用Western blot方法进行验证，并对差异蛋白质进行生物信息学分析，从蛋白分子水平探讨天芪益智颗粒的作用机制。

1  实验材料

1.1  动物

雄性SPF级SD大鼠72只，4月龄，体质量250～300 g，中国食品药品检定研究院提供，动物许可证号SCXK（京）2014-0013。饲养于北京中医药大学东方医院实验动物中心SPF級动物实验室，温度（24±2）℃，相对湿度（50±10）%，自由摄食饮水，12 h/12 h明暗交替。实验程序根据NIH《实验动物的护理和使用指南》进行，该程序经北京中医药大学东方医院动物护理和使用委员会审查批准。

1.2  药物

天芪益智颗粒，北京中医药大学药学院，批号20140913;石杉碱甲片，河南太龙药业有限公司，批号140910A。

1.3  主要试剂与仪器

Aβ1-42（美国Sigma-Aldrich），TMT sixplex Label Reagent Set（美国Thermo Scientific Pierce），兔抗Mdh2（Cell Signaling Technology，#8610），兔抗Fadd （Abcam，ab124812），小鼠抗β-actin（Santa Cruz，sc-47778），山羊抗小鼠IgG-HRP（Santa Cruz，sc-2302），山羊抗兔IgG-HRP（Santa Cruz，sc-2004），RIPA裂解液（Roche Diagnostics），ECL试剂盒（Amersham Pharmacia Biotech）。Morris水迷宫实验系统（中国医学科学院药物研究所，DMS-2），涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），酶标仪（Thermo，Multiskan MK3），RIGOL L-3000高效液相色谱系统（北京普源精电科技有限公司），GeneGnomeXRQ生物成像系统（Syngene），高效液相色谱仪（Thermo Scientic EASY-nLC 1000 System，Nano HPLC），质谱系统（Thermo，Q-Exactive）。

2  实验方法

2.1  分组

将实验大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、阳性药组和天芪益智颗粒高、中、低剂量组，每组12只。

2.2  造模

参考文献[11]方法，采用Aβ1-42微量注射法建立AD大鼠模型。操作步骤：将Aβ1-42溶解在六氟异丙醇中至终浓度4 μg/μL，4 ℃孵育48 h形成Aβ1-42寡聚体。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，使用立体定向仪固定头部，对手术区域消毒，在颅骨中部纵向切口以暴露颅骨。分离骨膜后暴露头骨，于前囟后3 mm、中线旁开2.2 mm处，用牙科钻打开颅骨，使用微量进样器垂直进针3 mm，将Aβ1-42寡聚体溶液缓慢注入两侧海马，注射时间5 min，留针5 min。假手术组注射等体积无菌生理盐水。

2.3  给药

造模后6 d开始给药，天芪益智颗粒高、中、低剂量组分别给予0.76、0.38、0.19 g/kg天芪益智颗粒药液灌胃，阳性药组给予0.02 mg/kg石杉碱甲灌胃，假手术组和模型组给予等量无菌生理盐水灌胃。给药体积均为0.5 mL/100 g，每日1次，连续40 d。

2.4  Morris水迷宫实验

采用Morris水迷宫实验评价各组大鼠空间学习和记忆能力。水迷宫由圆形水池、可移动平台和图像采集分析系统组成。实验前1 d，将大鼠置于平台30 s后使其入水，自由游泳60 s后，将其再次置于平台30 s。首先进行可视平台测试，平台位于目标象限并使其顶部高于水面2 cm，记录大鼠找到平台的逃避潜伏期和总路程。定位巡航实验：目标象限为第一象限，平台位于水面下2 cm，实验连续5 d，大鼠从除目标象限外的任一点入水，测定大鼠找到平台的逃避潜伏期。空间探索实验：撤去平台，将大鼠从除目标象限外的任一象限入水，测定大鼠穿越目标象限的次数，记录其在目标象限的停留时间。

2.5  TMT蛋白质组学分析

2.5.1  样品蛋白提取及胰酶酶解

水迷宫实验结束后，模型组和天芪益智颗粒高剂量组大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉并处死，冰上快速分离脑组织，用预冷的生理盐水冲洗干净。每组分别随机选取3只大鼠脑组织，将皮层和海马组织样本中加入适量裂解液（8 mol/L尿素，100 mmol/L Tris，1×蛋白酶抑制剂，pH 8.5）中，涡旋混匀，超声破碎5 min，使蛋白完全溶解，蛋白悬浮液4 ℃、15 000×g离心10 min，取上清分装后冻存于-80 ℃冰箱。采用Bradford法测定蛋白溶液的蛋白浓度。使用胰蛋白酶进行蛋白酶切，将酶切样品溶液加入脱盐柱中进行脱盐处理。

2.5.2  TMT标记

各组蛋白样品脱盐后，使用TMT标记试剂盒进行标记。标记的样品是大鼠的脑组织，从每组中随机选择3只大鼠进行生物学复制，将所有大鼠脑组织样品混合，用作重复实验的内标。将TEAB缓冲液、TMT标签和干粉状态下的样品从-20 ℃转移至室温下平衡。制备100 mmol/L TEAB溶液。将单个样品（不超过100 μg/TMT标签）溶于TEAB缓冲液，充分混匀，放置10 min。每个TMT试剂瓶中加入不高于100 μL蛋白样品溶液，涡旋振荡，孵育1 h，向每个瓶中加入5%羟胺8 μL终止反应，孵育15 min。标记结束后，立即将蛋白样品真空冻干，-80 ℃冰箱保存备用。

2.5.3  肽段混合及LC-MS/MS检测

将混合标记后的样品用100 μL乙腈流动相溶液溶解，14 000×g离心20 min，取上清液，在高pH条件下进行反相色谱梯度分离。将分离得到的组分用2%乙腈+0.1%甲酸20 μL复溶。12 000×g离心10 min，吸取上清液，采用夹心法上样，上样体积10 μL。

质谱分析时，喷雾电压为2.41 kV，毛细管温度为25 ℃，离子源为EASY-喷雾源，一级全扫扫描范围为350～1600 m/z，分辨率为70 000 FWHM，扫描时间为60 ms，二级图谱扫描范围为350～1600 m/z，分辨率为17 500 FWHM，扫描时间为70 ms。

2.5.4  质谱数据分析

质谱分析由Thermo Q-Exactive型质谱系统完成，产生的质谱原始文件采用Thermo公司的配套软件Proteome Discoverer进行处理。数据库的选择以所需物种、数据库注释完备性及序列可靠性为参考依据，使用UNIPROT Rat数据库，静态修饰选择甲酰胺甲基化修饰，动态修饰选择氧化修饰。对组间原始数据的ratio进行过滤后，进行t检验，确定差异表达的蛋白质，进行下一步分析。

2.6  生物信息学分析

2.6.1  GO分析

将差异蛋白质编号上传至PANTHER分类系统网站（http：//www.pantherdb.org）进行GO功能注释分析，通过检索分析，得出差异蛋白的分子功能、生理学过程、亚细胞定位及信号通路分类结果，并得出参与细胞各种功能的蛋白质数目，从整体上把握蛋白质与分子功能之间的相关性，提示与疾病及药物高度相关的蛋白质分子，分析药物的作用特征[12]。

2.6.2  蛋白质相互作用网络分析

STRING是ELIXIR的核心数据资源之一，是收载已知或预测蛋白质相互作用（PPI）的数据库。在STRING中添加需要计算分析的蛋白质，以创建PPI网络。将差异蛋白质编号信息上传至蛋白网络在线分析系统STRING10.5进行PPI分析，分析得出药物对差异蛋白网络影响的特征[13]。

2.7  Western blot检测蛋白表达

每组随机选取3只大鼠，取皮层、海马组织，在含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中冰上匀浆，4 ℃、15 000×g离心20 min，用BCA法测定上清液蛋白浓度。通过SDS-PAGE分离等量蛋白质，电泳转移至预先用100%甲醇处理的PVDF膜，将PVDF膜在含有5%脱脂奶粉的PBST缓冲液中封闭1.2 h。4 ℃将膜与用含有5%脱脂奶粉的PBST缓冲液稀释兔抗Mdh2（1∶1000）、兔抗Fadd（1∶1000）和小鼠抗β-actin（1∶5000）孵育过夜。辣根过氧化物酶缀合抗兔二抗（1∶5000）和抗小鼠二抗（1∶2000）检测。最后用ECL化学发光试剂在GeneGnomeXRQ生物成像系统中曝光条带，使用Image J软件分析图像。

3  统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以±s表示，Morris水迷宫实验中定位巡航实验结果使用双因素重复测量方差分析，空间探索实验结果使用方差分析比较组间差异;蛋白质定量分析使用Student's t检验进行组间差异分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4  结果

4.1  天芪益智顆粒对Morris水迷宫实验模型大鼠学习记忆能力的影响

定位巡航实验：随训练时间的延长，各组大鼠逃避潜伏期均缩短。第3～5日，与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期显著延长，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，阳性药组和天芪益智颗粒高、中、低剂量组大鼠逃避潜伏期缩短，部分时点差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。见表1。空间探索实验：与假手术组比较，模型组大鼠在目标象限停留时间百分比和穿越目标象限次数明显减少，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;与模型组比较，阳性药组和天芪益智颗粒高、中剂量组大鼠在目标象限停留时间百分比和穿越目标象限次数均显著增加，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。见表2。

4.2  蛋白質组差异蛋白鉴定结果

经LC-MS/MS检测分析、蛋白数据库检索及组间差异比较，成功鉴定出33个天芪益智颗粒高剂量组与模型组差异蛋白质，详见表3。这些差异蛋白的功能与能量代谢、神经信号传递、神经营养、细胞凋亡、蛋白质运输、细胞骨架等脑神经细胞生理、病理过程密切相关，其细胞定位包括线粒体、细胞膜、细胞质、细胞核、髓鞘、细胞骨架、内质网等部位，详见表4。

4.3  差异蛋白GO功能分类结果

GO分类结果显示，这些差异蛋白分子功能涉及蛋白结合活性、催化活性、受体活性、信号传导活性、结构分子活性、转运活性（见图1A）;生物学过程涉及生物调节、生物合成、细胞过程、发育过程、细胞定位、代谢过程、应激反应等（见图1B）;细胞组分包括大分子复合物、细胞膜、细胞器等（见图1C）;信号通路涉及ATP合成、凋亡信号通路、RhoGTP酶对细胞骨架的调控、Fas信号通路、谷氨酰胺-谷氨酸转化通路、糖酵解、三羧酸循环信号通路等（见图1D）。

4.4  差异蛋白蛋白质相互作用分析结果

所有差异蛋白质构成了一个蛋白调控拓扑网络，34个蛋白间有相互作用关系，拓扑网络中包含4个子网络：红色子网络团与线粒体三羧酸循环相关，丙酮酸脱氢酶Pdha1为关键节点蛋白;绿色子网络与线粒体膜呼吸链代谢相关，NADH脱氢酶铁硫蛋白2为关键节点蛋白;黄色子网络与ATP能量代谢相关，ATP合成酶Atp5h为关键节点蛋白;蓝色子网络与蛋白质合成相关。Atp5c1、Atp5d、Pdha1、Atp5o、LOC685778、Dlat和Cyc1是调控网络中预测的相关蛋白质，见图2。

4.5  Western blot检测结果

与对照组比较，模型组大鼠苹果酸脱氢酶（Mdh2）和Fas相关的死亡结构域蛋白（Fadd）表达明显下调，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，天芪益智颗粒高剂量组大鼠Mdh2和Fadd表达均显著上调，天芪益智颗粒中剂量组大鼠Fadd表达明显上调，差异均有统计学意义（P<0.01），见图3。该结果与TMT蛋白质组学分析结果一致。

5  讨论

红景天和红芪均为生长于高海拔、寒冷地区的中药，具有较强的抗氧化和神经保护作用。红景天苷是一种苯丙素苷，具有神经保护、缓解Aβ诱导的神经毒性、抑制氧化损伤和神经元凋亡等作用[14]。红芪多糖具有明显的抗氧化、免疫调节、神经保护、抗炎症反应等药理作用[15]。Morris水迷宫实验结果表明，天芪益智颗粒对AD大鼠学习记忆能力具有明显改善作用;TMT蛋白质组学分析结果表明，天芪益智颗粒能调节AD大鼠皮层和海马组织33个蛋白质的表达水平;Western blot检测结果表明，差异蛋白Mdh2和Fadd的表达变化与TMT蛋白质组学分析结果一致。

已有研究表明，AD患者学习记忆能力下降及其他神经功能障碍与神经细胞线粒体能量代谢紊乱、炎症反应、氧化应激、信号转导、细胞骨架、蛋白转运及细胞凋亡密切相关[16]。大脑能量代谢被认为是大脑功能障碍的敏感指标，其中线粒体能量代谢异常是线粒体损伤的主要原因之一，包括三羧酸循环或氧化性呼吸链的异常。线粒体级联假说认为，当细胞线粒体损伤达到一定阈值时将引起AD患者脑组织的病理变化[17]。本实验结果表明，天芪益智颗粒高剂量组能上调AD大鼠脑组织能量代谢蛋白包括ATP合成酶、ADP/ATP转位酶、NADH脱氢酶泛醌复合物Ⅰ、NADH脱氢酶泛醌黄素蛋白2、丙酮酸脱氢酶（乙酰基转移）激酶同工酶、线粒体丙酮酸载体蛋白2、Mdh2、线粒体钙离子转运体、γ-烯醇酶，增强神经信号转导蛋白谷氨酸脱氢酶1、神经素蛋白的表达，药物可明显增强细胞骨架蛋白Stathmin及微管相关蛋白RP/EB家族成员3、Torsin-1A蛋白的表达，从而发挥认知改善和神经保护作用。

综上所述，天芪益智颗粒能明显改善AD大鼠学习记忆能力，对AD大鼠皮层和海马组织中33个蛋白的表达有明显调节作用，表明药物对AD大鼠脑神经细胞的能量代谢、氧化应激、信号转导及细胞骨架蛋白表达具有明显调节作用，这些蛋白可能是药物作用的蛋白靶标，值得进一步深入研究药物有效成分与这些蛋白靶标的结合能力，以及对相关信号通路蛋白的影响，为天芪益智颗粒的临床应用和作用机制研究提供依据，同时也为该药的新药研发提供数据支持。

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（收稿日期：2019-02-27）

（修回日期：2019-03-09;编辑：华强）