Cryoleaf和Cryoloop冷冻载体冻融胚胎移植结局

张小建 彭礼繁 李晓洁 廖梅旭 余 鲲 龙华洋 邓 芳

四川省医学科学院四川省人民医院(成都，610110)

美国CDC的数据表明，35岁以下的产妇中，冻融移植周期(FET)出生婴儿占比从1997年的12%上升到2011年的25%，说明了FET在试管婴儿治疗成功率中的重要性[1]。而玻璃化冷冻技术已经成为辅助生殖领域的重要技术手段之一。最近10余年，如cryoloop等一些独特的玻璃化冷冻载体被开发并加以应用[2-3]，近一步提高了玻璃化冷冻的效果。早期的玻璃化冷冻趋向采用开放式载体如Cryoloop[2-4],Cryoleaf[5]，Cryotop[6]和OPS[7-10]。Cryoloop 和Cryoleaf作为目前较为常用的两种开放式载体，在实际应用中是否存在差异，目前没有相关文献的报道。本研究总结了本中心使用过的两种开放式载体对FET妊娠结局的影响，旨为今后的应用提供数据支持。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2009年1—2015年12月在本院生殖中心接受FET治疗患者的临床资料，根据冷冻载体分为Cryoloop组和Cryoleaf 组，根据胚胎发育时期不同将每组分为分裂期组(D3)和囊胚组(D5/D6)。纳入标准：胚胎冷冻方法为玻璃化冷冻；排除标准：①解冻后无存活胚胎取消移植者；②采用程序化冷冻者。

1.2 治疗过程

1.2.1促排卵方案使用基因重组卵泡刺激素(Gonal-F)联合促性腺激素释放激素拮抗剂(Orgalutran，欧加农)进行促排卵治疗。当2个优势卵泡超声下直径达到18mm后注射250～500μg人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导成熟。hCG注射36～38h后，在阴道超声下穿刺获取卵母细胞。

1.2.2受精方法穿刺获得的卵丘复合物在G-IVF培养液中置于37℃， 5%O2，6%CO2环境中等待受精。受精在hCG注射39～40h进行，受精浓度控制在2～5万条活动精子/卵母细胞。ICSI在hCG后41～42h内进行。受精后16～18h观察原核以确定受精情况。受精卵在G-1(Vitrolife)培养液中培养，直至第3天移植。移植当天对胚胎进行评级[11]，同时结合患者自身情况，充分知情同意后对移植后剩余的胚胎进行冷冻或行囊胚培养。

1.3 冷冻程序

胚胎采用两步法冷冻[12]。 二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、蔗糖和聚蔗糖(Sigma-Aldrich产品)作为冷冻保护剂，以Cryoleaf (Medicult, Jyllinge, Denmark) 或 Cryoloop(Hampton Research, USA)为载体，每支载体放置胚胎数≤3个。所有的冷冻液当天配制，以G-MOPS为基础冷冻液(VS)，各添加7.5%体积比的DMSO和EG为VS1，1M蔗糖溶液添加1mg/ml聚蔗糖(Ficoll-70),各添加15%体积比的DMSO 和EG为作为VS2。所有冷冻步骤均在37°C条件下进行。简要步骤为：胚胎在VS液中保持5min；转入VS1中反复清洗，并保持2min；然后将胚胎快速转入VS2做的2个微滴中，每个微滴放置15s,快速装管后投入液氮，长久保存。胚胎在VS2中清洗及装管时间不能超过30s。

1.4 解冻程序

分裂期胚胎解冻程序含5个步骤，以G-MOPS PLUS(VITROLIFE AB, Sweden)为基础液，添加蔗糖，分别配制使用液。解冻程序：0.8M蔗糖溶液1min, 转入0.6M蔗糖溶液1min, 0.33M蔗糖溶液2min, 0.2M蔗糖溶液3min, G-MOPS体外操作液5min，最后转入囊胚培养液培养至移植。分裂期胚胎于移植前一天下午解冻。移植前对胚胎情况进行评级，卵裂球存活达到全部卵裂球的≥50%定义为存活。囊胚解冻液配制如上，解冻程序为0.33M蔗糖溶液2min, 0.2M蔗糖溶液3min, G-MOPS 体外操作液5min. 转入囊胚培养液培养至移植，囊胚解冻于移植当天进行。所有操作均在37℃进行。

1.5 内膜准备

1.5.1自然周期在月经周期第12天行B超卵泡监测，同时测定血雌激素(E2)和黄体生成素(LH)水平， 评估卵泡和内膜发育情况，确定排卵时间。当B超提示内膜厚度≥8 mm且E2≥650 pmol/L，排卵后2～3d行分裂期胚胎移植或排卵后5d行囊胚移植，排卵后予以黄体酮60mg/d肌内注射，直至捡测hCG日。

1.5.2激素替代周期在月经周期第2～5d起口服戊酸雌二醇(商品名称：补佳乐)早晚各2片(1 mg/片)，每隔3～5 d予B超监测内膜厚度，根据内膜厚度逐渐增加戊酸雌二醇用量至早晚各4片。当内膜厚度≥8 mm且E2水平≥650pmol/L，孕酮(P)<5.0nmol/L时加用孕激素转化内膜。自转化日后的2～3 d行分裂期胚胎或5 d后行囊胚移植。

1.6 研究指标

包括胚胎存活率、植入率、临床妊娠率、多胎妊娠率、早期流产率、活产率及异位妊娠率。各统计指标的计算方法参照中华医学会生殖医学分会专家共识[12]。 胚胎存活率=存活胚胎数/复苏胚胎数×100%(分裂期胚胎解冻后存活卵裂球数大于或等于冷冻前卵裂球数的1/2定义为存活胚胎)；植入率=孕囊数/移植胚胎数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；异位妊娠率=异位妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%；多胎妊娠率=多胎妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%；早期流产率=孕12周内自然流产周期数/临床妊娠周期数×100%。

1.7 统计学分析

数据运用SPSS软件进行统计分析。计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较

本研究共纳入分裂期胚胎冻融周期596个，囊胚冻融周期502个。 Cryoleaf 组和Cryoloop组的患者在年龄、病因分布、原发/继发比等一般资料比较无差异(P>0.05)，见表1。

2.2 分裂期胚胎比较

Cryoleaf组的移植周期数和胚胎数高于Cryoloop组，但Cryoloop组的胚胎存活率、临床妊娠率以及胚胎植入率均高于Cryoleaf组(均P<0.05)，见表2。

2.3 囊胚比较

Cryoloop组临床妊娠率和活产率与Cryoleaf组无统计学差异(P=0.280)。Cryoloop组胚胎植入率高于Cryoleaf组(P<0.05)，详见表2。

表1 两组患者一般情况比较

表2 采用不同冷冻载体FET周期结局比较

3 讨论

开放式载体使胚胎与液氮直接接触，降温速度明显增快，同时减少了冷冻剂对胚胎的渗透，降低了毒性，能够明显提高胚胎复苏存活率，降低胚胎碎片率[13]。目前可供选择的冷冻载体较多，每个商品都有其优缺点。研究发现开放式载体Cryotop和封闭式载体CryoTipTM在单囊胚冷冻复苏移植中，临床妊娠率和分娩率无统计学差异[14]。张建瑞等[15]对比了半开放式载体和封闭式载体在卵裂期胚胎移植中的效果，结果临床妊娠率和种植率也无统计学差异。

本研究比较了玻璃化冷冻中常用的两种冷冻载体Cryoleaf和Cryoloop在FET中的效果，结果发现，分裂期胚胎即使移植胚胎数有优势，采用Cryoleaf作为冷冻载体的胚胎存活率及妊娠率也低于Cryoloop。而囊胚移植在妊娠率方面，两种载体的效果趋于一致，但是胚胎着床率仍然是Cryoloop优于Cryoleaf。国内外的相关研究也证实，开放式载体对卵裂期胚胎解冻效果优于封闭式载体[16-17]，主要是由于两种载体的结构差异所致。每个细胞由于体积和表面积比率的差异，对冷冻温度的适应范围不同；而由于细胞膜透性等原因，对水分的通过率也存在差异。当使用Cryoleaf作为载体时，胚胎放置到载体上形成半球形接触面，胚胎与载体直接接触的卵裂球与游离面的卵裂球因为与液氮接触面存在差异导致降温速度不一致，影响靠近载体面的卵裂球降温速度。而采用Cryoloop为载体时，胚胎形成一个类似悬空的球状体，整个球体与液氮的接触较为充分，降温速度也较一致。接触面的物理结构也可能影响胚胎后期的发育。由于Cryoleaf的半球形微滴，液体在降温过程中与载体形成挤压力，靠近半球体切面位置的胚胎会受到与其他位置卵裂球不一致的皱缩挤压力，采用Cryoloop后可避免这种情况的发生。降温速度与接触位置的差异，且分裂期胚胎卵裂球细胞比囊胚细胞体积大，对外环境影响的敏感性较强，这些可能是导致本研究中分裂期胚胎临床结局在Cryoloop 组优于Cryoleaf组的原因。

本研究为回顾性分析，且样本量有限，更为准确的结果还需长期、大样本、前瞻性研究。