脂联素亚型及浓度对类风湿关节炎软骨细胞促炎作用的影响

李炳彤，贾淑媛，李 萍

(吉林大学中日联谊医院 风湿免疫科，吉林 长春130033)

类风湿关节炎(RA)是一种慢性系统性自身免疫性疾病，以持续性滑膜炎和关节软骨和软骨下骨的进行性损伤为特征[1]。软骨细胞与滑膜成纤维细胞(一种RA关节病变的主要效应细胞[2])相互作用，同时软骨细胞的存活状态和细胞外基质的代谢状态直接影响关节功能[3]。脂联素，也称为GBP28，apM1，Acrp30或AdipoQ，于1995年被发现，研究显示其为脂肪细胞中高表达的蛋白质[4-6]。脂联素并不是一个同质的单一体，而是由不同寡聚体的几种亚型组成。低分子量(LMW)脂联素，也称Trimeric脂联素，由3个全长脂联素单体组成，中分子量(MMW)脂联素，由2个三聚体结合形成的六聚体，高分子量(HMW)脂联素，由三聚体形成的十二到十八聚体[7]。此外，不同脂联素亚型在不同细胞中作用也不同[8，9]。研究发现，与健康人相比，RA患者的血清和关节滑液中的脂联素水平增加[10]，但脂联素对RA病理生理的影响，尤其是对软骨细胞的作用还不明确。因此，本研究旨在探讨不同浓度和亚型的脂联素与类风湿关节炎患者的软骨细胞(RAC)产生炎症因子之间的关系。

1 材料与方法

1.1 软骨细胞的分离和培养

软骨组织取自吉林大学中日联谊医院行膝关节置换术的RA患者及行创伤修复的健康人。RA患者的诊断符合1987年美国风湿病协会(ACR)修订的分类标准，健康人均排除风湿性疾病。本研究获得吉林大学中日联谊医院伦理委员会批准，患者均同意将其组织细胞用于研究。在无菌条件下取关节表面的软骨组织，剪碎后用胰酶和胶原酶消化。分离的软骨细胞经200目滤网过滤后，用含10%FBS的DMEM培养液在37℃、5%CO2条件下培养。

1.2 脂联素刺激软骨细胞

使用25 μg/ml、50 μg/ml和100 μg/ml浓度的HMW/MMW、Trimeric和Native脂联素分别刺激RAC和人软骨细胞(HC)，37℃、5%CO2条件下培养15小时，本研究刺激时间的选择基于其他实验研究[11]。收集培养上清液，分装后储存于-20℃以便下一步分析。

1.3 酶联免疫吸附(ELISA)法检测培养上清液中的TNF-α、MMP-3以及MMP-10水平

收集培养体系的上清液，采用ELISA法检测基质金属蛋白酶(MMP)-3、MMP-10和肿瘤坏死因子(TNF)-α的浓度，其中MMP-10试剂盒购自Abnova公司，MMP-3和TNF-α试剂盒购自博士德公司，检测过程严格遵照说明书。

1.4 统计分析

2 结果

研究发现与未刺激的RAC相比，不同浓度HMW/MMW、Trimeric和Native脂联素均可刺激RAC分泌MMP-3、MMP-10和TNF-α增加。HMW/MMW脂联素100 μg/ml与RAC共培养后，其分泌MMP-3的浓度增加至19.54倍，而MMP-10和TNF-α的浓度也较基础浓度升高，相应增加至1.74倍和1.54倍。应用100 μg/ml浓度的Trimeric脂联素刺激RAC后，MMP-3、MMP-10和TNF-α的浓度均较基础浓度升高，相应增加至7.10倍、1.07倍和1.22倍。应用100 μg/ml浓度的Native脂联素刺激RAC后，MMP-3、MMP-10和TNF-α的浓度增加至13.74倍、1.49倍和1.36倍。三种脂联素刺激RAC分泌炎症因子的水平升高，与未刺激RAC和相同浓度脂联素刺激的HC相比均有统计学差异(如表1)。

表1 三种脂联素亚型刺激RAC分泌炎症因子的差异

p1表示与仅用培养液培养的RAC相比较；p2表示与相同条件下HC相比较。MMP,基质金属蛋白酶;TNF,肿瘤坏死因子;RAC,类风湿关节炎患者的软骨细胞;HC,健康人的软骨细胞。

进一步分析了不同浓度(25 μg/ml、50 μg/ml和100 μg/ml)的3种不同亚型脂联素对RAC和HC分泌MMP-3、MMP-10和TNF-α的作用程度，结果如图1。3种脂联素对RAC和HC分泌炎症因子的作用均随浓度增加而增大。在3种脂联素中，HMW/MMW亚型脂联素作用最强，Native脂联素作用次之，而Trimeric亚型脂联素作用最弱，且三者之间的差异具有统计学意义(P<0.01)。

图1 浓度递增脂联素亚型对RAC和HC的刺激作用

* 表示与Native和Trimeric脂联素相比，P<0.01。MMP,基质金属蛋白酶;TNF,肿瘤坏死因子;RAC,类风湿关节炎患者的软骨细胞;HC,健康人的软骨细胞。

3 讨论

近年来，人们越来越关注脂肪因子在自身免疫性疾病发生发展中的重要作用。有学者已证实脂肪因子可作用于关节软骨、滑膜阻止以及T、B淋巴细胞[12]。脂联素是脂肪因子的一种类型，已有多篇文献证实在RA的脂联素在RA病情进展中起促炎作用[13，14]，另外，也有研究表明，与骨关节炎相比，RA患者血清和关节液的脂联素的水平明显升高[10，15]。经过我们的前期研究，还发现RA患者血清中不同脂联素亚型的表达水平不相同，且各亚型脂联素水平均明显高于健康人[16]。这些研究结果均提示脂联素对RA发生发展起重要作用，但针对不同浓度脂联素亚型对RAC影响的研究较少。本文主要探讨不同浓度和亚型的脂联素与RAC分泌炎症因子的关系，并选取MMP-3、MMP-10和TNF-α 3种与RA病理机制密切相关的炎症因子重点研究。

RA的重要病理改变是关节软骨和骨的破坏，进一步导致患者残疾并影响患者生活质量，而MMPs(如MMP-3和MMP-10)，在关节软骨及骨破坏过程中发挥重要作用[17]。MMPs在正常组织中的表达极其微弱，而在病变组织中异常升高[15]。我们的研究结果发现HMW/MMW、Trimeric和Native三种脂联素亚型均可刺激RAC表达MMP-3和MMP-10，并且这种刺激作用随浓度升高而增大，同时我们还发现HMW/MMW亚型脂联素的刺激作用最强，也就是说，HMW/MMW亚型脂联素的可能在促进关节软骨基质的破坏发挥了重要作用。

已有大量文献证实，在多种自身免疫病(特别是RA)的发生发展中TNF-α发挥了重要的促炎作用[18]，但脂联素在TNF-α表达过程中是发挥促炎还是抑炎作用，目前尚无定论。Ehling研究团队发现脂联素并不影响类风湿关节炎滑膜成纤维细胞表达TNF-α和血管内皮生长因子(VEGF)的水平[11]。但是，Lee等研究表明脂联素能够诱导炎症关节的成骨细胞分泌MMP-1、MMP-13、VEGF、白细胞介素(IL)-6和IL-8[19]。值得注意的是，上述研究均使用Native脂联素，而未对不同亚型脂联素的作用差异进行深入探讨。本研究发现HMW/MMW、Trimeric和Native脂联素均能浓度依赖性地升高RAC中TNF-α的水平，并且HMW/MMW亚型脂联素的作用最强，表明不同脂联素亚型可能通过升高TNF-α对RA关节炎症及关节破坏发挥作用。

综上所述，HMW/MMW、Trimeric和Native脂联素亚型均可通过促进RAC中MMP-3、MMP-10和TNF-α的分泌进而发挥促炎作用，其中HMW/MMW脂联素作用最强。因此，HMW/MMW脂联素可能在RA关节软骨基质破坏和血管翳形成的病理过程中发挥重要作用。尽可能降低关节内脂联素的水平，特别是HMW/MMW亚型，可能是治疗RA的新方法。