tTG在糖尿病心肌病中的表达及意义

黄宇欣，黄艳智，许 冰，曹 莹，谢雨欣，高海成，尹光浩，支晨阳

(1.长春工业大学材料科学与工程学院，吉林 长春130000；2.长春市儿童医院；3.吉林大学；4.长春中医药大学附属医院)

糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病(DM)的并发症之一，可引发心力衰竭、心律失常、心源性休克，重者可诱发猝死[1,2]。近年研究发现，组织型转谷酰胺酶(tTG)可在多种疾病中发挥重要的作用，如癌症、心肌纤维化、肝纤维化、肺纤维化及肾纤维化等[3]。为了进一步证实tTG在DCM中的作用，本实验利用降糖护心片干预由链尿佐菌素(STZ)诱导的大鼠DCM模型，分析tTG在DCM中的表达，由此明确tTG在DCM中的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，由上海士锋生物科技有限公司提供； MD-100自动生化分析仪(美国)； 徕卡4215切片机(德国)；Olympus PM-10AO全自动显微照相装置(日本)；tTG抗体和通用型SP kit试剂盒(Invitrogen)。

1.2 实验动物及处理

雄性Wistar大鼠15只，体重180-220 g，由辽宁长生生物技术有限公司提供。所有大鼠适应性喂养1周，将大鼠随机分为正常对照组(n=5)和模型组(n=10)。正常组用生理盐水刺激；而模型组注射30 mg/kg STZ造模，空腹血糖≥7.8 mmol/L即为造模成功。造模4 w后，随机将模型组分为模型组(n=5)和模型组+降糖护心片干预组(n=5)，除正常组和模型组用生理盐水刺激后，模型组+降糖护心片干预组，每天灌胃给予降糖护心片溶解液，至8 w后处死大鼠，取心脏组织用于HE染色、tTG组织化学染色以及拉蔓光谱检测。

1.3 HE学染色

10%福尔马林固定标本，常规石蜡包埋、切片。二甲苯脱腊10 min，100%乙醇换二甲苯2 min、95 %、80%及75 %乙醇置换1 min，水冲洗2 min。苏木素5 min。盐酸乙醇分化30 s。浸泡15 min。伊红染2 min。脱水，透明，封片。

1.4 tTG免疫组织化学染色

新鲜大鼠心脏组织通过固定、石蜡包埋、切片后，脱蜡至水。PBS洗 5 min，3% H2O2孵育；PBS洗掉H2O2，滴加tTG一抗过夜；再按通用型二抗试剂盒说明书按步骤执行染色；封片后，随机选取5个高倍镜视野，计算tTG在心肌组织中阳性表达。

1.5 紫外吸收光谱法

心脏组织经匀浆后，利用紫外吸收光谱分析心脏组织蛋白的波谱变化(严格按说明书执行)。选用UV-2450光谱在200-1 000 nm处检测匀浆液的吸收，由此分析心肌蛋白吸收谱改变 (nm)。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 紫外检测心肌病变结果

本实验选用紫外吸收光谱分析STZ诱导心肌损伤情况，进而判定模型是否构建成功。而实验结果显示：正常对照组出现三个明显的吸收峰，峰值分别是0.891,0.799 和 0.433。其吸收波长分别是539,576 和 972 nm。在注射STZ诱导的心肌组织后，其峰位移动，吸收值向左或向右移动1个单位，说明心肌组织蛋白成份发生改变(图1)。

2.2 HE染色结果

正常对照组心肌排列整齐，横纹清晰，有明显的胞核，无肿胀细胞。注射给予30 mg/kg STZ后大鼠心肌排列紊乱，局部心肌出现点状坏死，心肌出现明显的损伤。而给予降糖护心片后心肌排列逐渐整齐，胞核渐清晰(见图2A-C)。

2.3 tTG免疫组织化学染色结果

正常心肌细胞排列整齐，横纹清晰可见，有少量tTG表达，其灰度值为5.26±0.08(图3A)；在图3B中，tTG的阳性表达明显增加，其灰度值为14.26±0.05**(P<0.01)，说明tTG在DCM中可能扮演重要的作用，可作为DCM诊断的重要靶向因子。为了进一步分析tTG在DCM中的作用，我们采用降糖护心片进行大鼠DCM干预实验。结果发现，tTG的阳性表达减弱，其灰度值是8.52±0.04(*P<0.05)，这一结果进一步说明tTG在DCM中起着重要的作用(图3C)。

图1 紫外吸收光谱测定心肌组织蛋白的结果 (A：正常组；B：模型组)

图2 心脏组织的HE染色 (A：正常组；B模型组；C降糖护心片组)

图3 心肌组织中tTG组织化学染色 (A：正常组；B：模型组；C：降糖护心片组)**P<0.01，*P<0.05

3 讨论

糖尿病是由遗传因素，环境因素而造成的体内胰岛素不足，代谢紊乱性疾病[4]。近年来，随着人民生活水平的提高、人口老龄化和生活模式的改变，糖尿病的发病率呈逐年上升趋势[5]。DCM是糖尿病的并发症，由于其发病机制极其复杂，因此深入研究其发病机制成为当前亟待解决的问题。

拉曼光谱(Raman spectra)，是一种散射光谱。它在不损伤细胞的条件下，实时动态地分析细胞的分子结构变化，具有敏感性高、活样品不需固定或染色等众多特点[6]。本实验研究结果发现，拉曼光谱可快速地检测STZ诱导的大鼠糖尿病后的心肌损伤，可作为临床上诊断心肌损伤的快捷工具。近年来，我室一直致力于DCM发病机制的研究，发现tTG在DCM中呈现高表达，由此推测tTG可能是治疗DCM新的靶点[7]。tTG除在肝脏中表达丰富外，还可能在心脏、肺、肾、脾等器官中呈高表达[8]。而前期实验恰恰证实，tTG在DCM中起到重要的作用。为了进一步分析tTG在DCM中的作用，我们采用降糖护心片干预由STZ诱导的大鼠DCM模型，发现降糖护心片降低了tTG的蛋白表达，由此进一步证实了tTG在DCM中的作用，该成果为DCM的临床诊断提供了依据。