UPLC-QTOF/MSE联合UNIFI筛选平台快速分析牛膝中三萜皂苷类成分

傅 俊，吴 欢，吴 虹*

1安徽中医药大学药学院，合肥 230012；2新安医学教育部重点实验室，合肥 230038

牛膝始载于《神农本草经》，为苋科植物牛膝(AchyranthesbidentateBl.)的干燥根，具有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨、利尿通淋、引血下行的作用。研究表明[1]，牛膝中包含多种结构类型的化学成分，包括三萜皂苷类、植物甾酮类以及多糖等成分，其中三萜皂苷类成分是牛膝中的主要活性物质，具有抗炎镇痛，调节免疫和抗肿瘤作用[2，3]。目前，关于牛膝三萜皂苷的定性研究较少，缺乏系统性研究。

近年来，超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF/MS)以其高分离度、高灵敏度及高分辨率等特点广泛应用于中药成分定性分析，血清药物化学以及代谢组学等各个领域[4-7]。UNIFI[8，9]作为一个强大的信息处理平台，可以对样品的MSE数据自动进行离子流提取、分子式确定，同时与数据库中化合物进行比对，并根据高能量下化合物的碎片信息给出化合物可能的裂解方式，最后在预设的过滤条件下显示所鉴定化合物的详细信息。最终，本实验采用UPLC-QTOF/MSE结合UNIFI平台，对牛膝中40种三萜皂苷进行了快速、全面的定性分析，为牛膝三萜皂苷质量控制提供参考，同时为药效物质基础的进一步研究提供参考。

1 实验材料

Xevo G2-XS QTOF/MS、Masslynx V4.1工作站、UNIFI科学信息学系统(美国Waters公司)；ADW-1002-B型超纯水机(美国Aquapro公司)；KQ-200KDB型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；CP225D型电子天平(德国Sartorius公司)；色谱级甲酸(Fisher Scientific公司)；色谱级乙腈、甲醇(美国TEDIA公司)。

竹节参IVa(批号：CHB170227)纯度≥98%，竹节参皂苷IV(批号：CHB180524)纯度≥98%，人参皂苷Ro(批号：CHB170310)纯度≥98%，购于成都克洛玛生物科技有限公司。本实验所用牛膝药材(AchyranthesbidentateBl.)购自河南焦作市，经安徽中医药大学刘劲松教授鉴定为怀牛膝。

2 实验方法

2.1 样品溶液制备

取牛膝饮片适量，粉粹成细粉，称取粉末100 g，加入1 L乙醇加热回流提取3次，每次1 h，合并提取液，水浴浓缩浸膏至无醇味，加入蒸馏水定容至1 L，超声30 min后，抽滤，量取续滤液150 mL过D101型大孔吸附树脂柱，先用600 mL蒸馏水洗脱水溶性杂质，最后用600 mL 70 %乙醇洗脱，收集洗脱液，干燥至恒重。精密称定干燥粉末，加甲醇配成质量浓度为1 mg/mL溶液。同时制备空白对照样品。

2.2 对照品溶液的制备

精密称定竹节参皂苷IVa，竹节参皂苷IV，人参皂苷Ro适量，加甲醇定量至容量瓶，配成浓度为1 mg/mL的溶液。置于4oC冰箱备用， 0.22 μm微孔滤膜过滤后进样。

2.3 色谱条件

Phenomenex C18色谱柱(2.1 mm × 100 mm,1.6 μm)，流动相为0.1%甲酸水(A)—乙腈(B)，梯度洗脱：0～10 min，5%～30% B；10～11 min，30% B；11～12 min，30%～45% B；12～12.5 min，45%～47% B；12.5～15 min，47%～48% B；15～16 min，48%～50% B；16～19 min，50%～70% B；19～22 min，70%～85% B；22～24 min，85%～95% B；24～27 min，95% B；27～28 min，95%～5% B；28～30 min，5% B，流速0.2 μL/min，柱温30oC，进样量2 μL。

2.4 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，负离子模式扫描：扫描范围m/z50～1 200，毛细管电压2.5 kV，锥孔电压40 V，锥孔气流速50 L/h，离子源温度120oC，脱溶剂气(N2)流速600 L/h，脱溶剂气温度350oC。亮氨酸-脑啡肽[M-H]-=554.262 0作为LockSpray校准液(200 pg/mL)，流速10 μL/min，甲酸钠溶液用来仪器校正。

2.5 数据处理方法

为了便于对牛膝中三萜皂苷进行系统定性的分析，本实验首先对已有对照品进行质谱分析，总结出其色谱保留行为、裂解规律以及特征离子等。通过相关文献的查询以及质谱数据库(Chemspider，Mass Bank，SCIfinder等)建立UNIFI数据库，并根据皂苷母核上取代基的数量将牛膝三萜皂苷分为单取代类和双取代类化合物。再以UPLC-QTOF/MSE采集供试品数据。将MSE原始文件导入UNIFI平台，建立UNIFI筛选方法(对于2D检测最小峰面积设为200；3D检测中，低能量下的峰强度设为500，高能量峰强度为150；误差范围±5 ppm，负离子下加和的离子为+HCOO和-H)，对化合物进行自动识别。

3 结果与分析

3.1 牛膝三萜皂苷对照品UPLC-QTOF/MSE裂解规律解析

如图1所示，3种牛膝三萜皂苷对照品均在MSE低能量(6 V)下给出[M-H]-，而且都有一个特征的[M+HCOOH-2H]2-离子，该结果与文献报道一致[9]。MSE高能量下(80～100 V)，对照品倾向于先丢失C28位上的糖基，这可能是由于C28位酯键比C3位的醚键更易断裂，当五碳糖与六碳糖同时存在时，五碳糖优先于六碳糖丢失。三个对照品都有齐墩果酸母核的特征碎片离子m/z455.350 8，但未见齐墩果酸母核继续裂解而产生的碎片离子；同时可见C3位的葡萄糖醛酸(GluA)的准分子离子为m/z175.02 [GluA-H]-，其碎片离子为157.01 [GluA-H-H2O]-和113.02 [Glu-H-H2O-CO2]-；C28位的葡萄糖(Glu)的准分子离子为m/z179.05 [Glu-H]-，碎片离子为161.04 [Glu-H2O-H]-、143.03[Glu-H2O-H2O-H]-、131.03 [Glu-H2O-CH2O-H]-、119.03 [Glu-H2O-C2H2O-H]-以及113.02 [Glu-H2O-CH2O-H2O-H]-。

图1 3种牛膝三萜皂苷对照品在MSE模式下低能量(1)与高能量(2)质谱图Fig.1 Low energy (1) and high energy (2) mass spectra of three reference standard of Achyranthes bidentata in MSE mode

3.2 牛膝样品的UPLC-QTOF/MSE分析鉴定

牛膝皂苷提取物总离子流图如图2所示，结果共鉴定出40种三萜皂苷。其中在齐墩果酸母核上C3或C28仅有一个取代基的化合物13种，C3和C28位均有取代基的化合物25种，另有其它母核的三萜皂苷化合物2种。化合物保留时间、准分子离子及碎片离子信息详见表1。

3.2.1 齐墩果酸型单取代三萜皂苷化合物的鉴定

单取代化合物指齐墩果酸母核上C3或C28位只有一个取代基的化合物，本实验共鉴定出13种齐墩果酸型单取代三萜皂苷化合物。以峰25、27、35和36为例阐述其鉴定过程。峰25给出其[M-H]-为m/z793.437 6，通过MassLynx分析其分子式为C42H66O14，其在高能量下主要的特征碎片离子为m/z631.385 0 [M -Glu-H]-、613.374 2 [M-Glu-H2O-H]-、455.350 8 [M-Glu-GluA-H]-，通过与UNIFI鉴定结果相比对，推测其为姜状三七苷R1。峰27在低能量下给出m/z763.435 4 [M-H]-的母离子，与竹节参皂苷IV相比分子量少了162，推测其分子式为C41H64O13，高能量下特征碎片离子为m/z631.385 6 [M-Arabinose(Ara)-H]-、613.373 0 [M-Ara-H2O-H]-、455.352 6 [M-Ara-GluA-H]-，其中m/z631.385 6、613.373 0、455.352 6分别与竹节参皂苷IV的碎片离子相同，峰27鉴定为28-去葡萄糖竹节参皂苷IV。峰35在低能量下给出m/z617.405 1 [M-H]-的离子峰，峰36给出m/z663.411 7 [M+HCOO]—，二者在高能量下都产生了相同的碎片离子m/z455.35 [M-H-Glu]—，通过比对文献[10]，分别推测为3-O-β-D-葡萄糖基齐墩果酸苷和竹节参皂苷1。

图2 空白溶液(A)与牛膝样品(B)的总离子流图Fig.2 Total ion chromatograms (TIC) of blank solution (A) and Achyranthes bidentata sample (B)

表1 牛膝中三萜皂苷的UPLC-QTOF/MSE色谱及质谱数据Table 1 The chromatographic and mass spectrometric data of triterpene saponins identified from AB using UPLC-QTOF/MSE

续表1(Continued Tab.1)

峰号No.分子式Formula[M-H]—[M+HCOO]—偏差Error(ppm)保留时间tR(min)碎片离子Fragmentation ions鉴定化合物Identified compounds10C53H82O251 117.512 53.011.181 117.512 5,997.502 5,955.491 2,793.437 3,731.437 3,631.210 6,613.377 6,581.250 9,455.352 0,161.008 9Achyranthoside D11C48H76O19955.497 11.511.24955.452 2,793.440 8,731.439 0,631.384 5,613.374 7,569.385 9,455.350 8,157.013 5Ginsenoside Ro12C47H74O21973.461 8-3.311.49973.461 8,811.415 8,648.354 3,472.312 6β-D-glucopyranosyl 3β-[O-α-L-galactopyranosyl-(1→2)-O-α-D-glucopyranurono-syloxy] machaerinate13C47H74O18925.481 61.511.74925.481 6,793.434 4,631.386 5,613.369 6,455.350 8,157.013 6Chikusetsusaponin IV14C54H84O251 131.525 82.612.141 131.525 8,969.466 3,954.443 7,631.385 0,793.543 9,455.352 7,157.013 9Achyranthoside D methyl es-ter15C47H70O23S1 033.392 7-2.814.051 033.392 7,953.440 8,763.425 7,613.374 1,569.384 6,455.352 6,157.013 6Sulfachyranthoside B16C47H72O20955.456 42.114.24955.456 4,793.437 3,631.384 3,613.374 3,455.352 6,175.024 9 Achyranthoside C17C48H76O18985.502 92.614.31985.502 9,777.440 2,615.388 8,455.351 6Momordin Iia18C47H70O20953.439 40.714.48953.439 4,793.437 1,631.385 0,613.374 3,455.352 7,161.009 1Achyranthoside B or Bident-atoside I19C47H72O20955.45450.115.07955.454 5,835.443 9,793.436 7,613.374 1,455.351 8,161.008 8Achyranthoside G20C48H72O20967.451 9-2.615.18967.451 9,792.394 8,632.386 3,455.351 6,161.008 3Achyranthoside A21C49H78O191 015.512 11.315.501 015.512 1,789.439 0,627.386 8,455.351 8Chikusetsusaponin V methyl ester22C49H76O20983.484 6-1.115.68983.484 6,793.435 9,455.352 0,175.024 4,113.024 2Achyranthoside C dimethyl ester23C48H74O19953.472 8-2.516.06953.440 8,791.416 4,629.367 7,569.386 4,455.352 6Achyranthoside E dimethyl ester24C47H74O18925.472 3-.8.016.31925.472 3,793.436 6,631.384 0,455.352 1Pseudoginsenoside RT1

续表1(Continued Tab.1)

峰号No.分子式Formula[M-H]—[M+HCOO]—偏差Error(ppm)保留时间tR(min)碎片离子Fragmentation ions鉴定化合物Identified compounds25C42H66O14793.437 6-0.516.42793.437 6,631.385 0,613.374 2,455.350 8,157.013 2,113.024 0Zingibroside R126C47H70O20953.440 11.417.30835.448 0,793.437 3,613.374 2,455.352 5,161.008 8Bidentatoside I or Achyran-thoside B27C41H64O13763.435 40.917.50763.435 4,631.385 6,613.373 0,455.352 6,175.024 628-Desglucosylchikusetsusa-ponin IV28C41H62O15793.397 9-4.718.22793.397 9,631.385 5,455.352 9,161.008 928-deglucosyl-achyrantho-side C29C42H66O14793.440 22.718.49793.440 2,631.384 6,613.374 7,569.385 9,455.350 8,175.024 7,113.024 6Chikusetsusaponin Iva30C43H68O14853.459 90.818.42853.459 9,645.367 9,455.352 7,113.024 1Chikusetsusaponin Iva meth-yl ester31C41H60O15791.386 10.318.73791.386 7,631.385 2,613.374 2,455.352 8,175.024 4,113.024 1Achyranthoside iv32C36H58O9679.404 3-1.318.89679.404 3,471.346 4Hederagenin-28-O-β-D-glu-copyranosyl ester33C40H60O14763.391 50.719.17763.391 5,631.383 4,455.352 7,130.998 428-deglucosyl-achyrantho-side E34C36H56O9631.383 7-2.3719.48631.383 7,455.350 9,175.024 428-Desglucosylchikusetsusa-ponin IVa35C36H58O8617.405 1-1.319.73617.405 1,455.353 4,113.024 3Oleanolic acid 3-O-β-D-glu-copyranoside 36C36H58O8663.411 70.419.91663.411 7,455.352 9,161.045 1Chikusetsusaponin-137C53H82O28S1 197.259 421.401 197.259 4,1117.504 2,955.483 4,79.394 7,631.113 7,455.352 6,175.024 1Sulfachyranthoside D38C37H60O9633.399 9-1.422.09633.399 9,455.352 6,113.024 1Oleanolic acid 3-O-β-D-glu-copyranoside-6-O-methyl es-ter39C46H74O14895.509 51.622.51895.509 5,687.443 5,455.351 7,161.046 5Chikusetsusaponin Iva butyl ester40C41H62O14777.404 9-2.322.62777.404 9,631.384 6,613.373 0,455.351 5,175.024 33-O-β-D-Glc-(1→2)-[[2-carboxy-1-(carboxymethyl)-2-hydroxyethyl-(1→3)]-β-D-GluA oleanolic acid

3.2.2 齐墩果酸型双取代三萜皂苷化合物的鉴定

双取代化合物指齐墩果酸母核的C3和C28位上同时具有取代基的化合物，本实验共鉴定出25种双取代化合物。现以峰10和峰24为例，阐述双取代化合物鉴定过程。峰10在低能量下给出一个 [M-H]-m/z1 117.512 5以及[M+HCOOH-2H]2-m/z581.250 9，高能量下主要特征碎片离子m/z955.491 8 [M-H-C5H7O6]-、793.437 9 [M-H-C5H7O6-Glu]-、631.384 4 [M-H-C5H7O6-2Glu]-和455.353 1 [M-H-C5H7O6-2Glu-GluA]-(如图3)，可推测该化合物为牛膝皂苷D，其可能裂解途径如图4所示。峰24在低能量下给出一个[M-H]-m/z925.472 3 以及[M+HCOOH-2H]2-m/z485.238 5，高能量下产生的碎片离子m/z793.436 6 [M-H-xylose(Xyl)]-、631.384 0 [M-H-Xyl-Glu]-、455.352 1 [M-H-Xyl-Glu-GluA]-，结合文献报道[11]，将其鉴定为假人参皂苷RT1。

此外，本实验通过UNIFI自建数据库以及在线数据库发现，峰12和峰32与上述三萜皂苷具有相同质谱行为，但碎片离子中并未发现齐墩果酸母核455.35的碎片离子，通过软件自带元素分析功能确定分子式以及在线数据库确定可能结构，最终峰12和32分别被推测为β-D-glucopyranosyl 3β-[O-α-L-galactopyranosyl-(1→2)-O-α-D-glucopyranuronosyloxy] machaerinate和hederagenin-28-O-β-D-glucopyranosyl ester，两者均为非齐墩果酸型三萜皂苷。

4 讨论

本实验通过UPLC-QTOF/MSE技术结合UNIFI平台对牛膝中的三萜皂苷进行了快速的分析。在MSE模式下高、低能量动态变化的碰撞诱导解离过程中，可以实现一次进样即可同时获得化合物的准分子离子峰及相关碎片信息[12]。为了获取三萜皂苷丰富的离子信息，更为全面的推测化合物的结构，本实验比较了正、负离子两种质谱扫描模式，结果显示三萜皂苷在负离子模式下质谱响应较好，故最终确定为负离子模式下进行分析。同时本实验考察了水-乙腈以及0.1%甲酸水-乙腈不同流动相对色谱峰的影响。最终采用了能有效改善峰形和离子化效果的0.1%甲酸水作为水相。此外，UNIFI平台，可以按预设参数，进行成分的自动解析，并给出可能的裂解过程，极大的简化了分析过程。本实验根据对照品的裂解规律以及相关文献，结合样品在MSE模式下的精密分子质量、碎片离子以及保留时间等信息，通过UNIFI平台进行UNIFI自带数据库、自建数据库以及在线数据库(Chemspider,MassBank等)的检索比对并利用MassLynx工作站进行人工核对。共鉴定了40种三萜类皂苷类成分，其中在齐墩果酸母核上C3或C28仅有一个取代基的化合物13种，C3和C28位均有取代基的化合物25种，另有其它母核的化合物2种。

图3 牛膝皂苷D的UNIFI结果报告图：提取 离子流图(A)，低能量(B)及高能量质谱图(C)Fig.3 UNIFI results of Achyranthoside D: Extract ion chromatograms (A),low energy (B) and high energy (C) mass spectrometry

图4 牛膝皂苷D可能裂解途径Fig.4 Possible fragmentation pathways of Achyranthoside D

另外，本实验发现齐墩果酸型三萜皂苷在负离子模式下存在一定的规律性：当C3位有取代基时会产生一个[M-H]-的准分子离子峰，但当单取代在C28位时，会产生一个[M+HCOO]-的准分子离子峰；当C3和C28位均有取代基时，C28位的取代基优于C3位取代基先脱去，五碳糖(Ara,Xyl)优于六碳糖(Glu)脱去。此外，当C3和C28位均有取代基时，除了会产生一个[M-H]-的准分子离子峰外，还会产生一个特征的[M+HCOOH-2H]2-分子离子峰。

总之，UPLC-QTOF/MSE以其高灵敏、高分辨率的特点结合UNIFI强大的数据处理能力能快速为牛膝中的三萜皂苷作定性分析，为中药有效成分的鉴定提供了参考，同时也为牛膝皂苷的药效物质、质量控制研究提供科学依据。