组织定居巨噬细胞在维持免疫稳态中的研究进展①

强丽华 张 勇 刘翠华

(中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室，北京 100101)

巨噬细胞是一类重要的固有免疫细胞，广泛参与免疫清除和免疫调节等过程。巨噬细胞主要包括由造血干细胞经由单核细胞分化而来的巨噬细胞和定植于局部的组织定居巨噬细胞(Tissue-resident macrophages)。组织定居巨噬细胞受局部组织微环境的调控，是一类高度异质的细胞群，在机体免疫稳态维持中发挥重要作用并与感染、肿瘤和自身免疫病等疾病的发生发展密切相关[1]。组织定居巨噬细胞几乎存在于机体的所有组织中。根据解剖位置和功能表型，可将其分为小胶质细胞(中枢神经系统)、破骨细胞(骨髓)、肺泡巨噬细胞(肺)、库普弗细胞(肝脏)、朗格汉斯细胞(表皮)等[2,3]。早期在单核吞噬细胞系统(Mononuclear phagocyte system，MPS)的理论中巨噬细胞被视为终末分化的血液单核吞噬细胞。近年来，对个体发育的研究表明巨噬细胞有众多来源，血液循环单核细胞对巨噬细胞群的贡献似乎仅限于一些特定的组织，例如肠道和真皮等部位[4]。这些组织和来源多样性的巨噬细胞表型和功能都是维持体内免疫平衡所必需的，不仅可以增强机体对环境的适应性，而且允许机体响应多种细胞因子和微生物感染等多种信号而快速改变细胞表型和生理状态。本文将对组织定居巨噬细胞的起源、其在组织微环境中的异质性和活化状态的可塑性，以及其在感染、肿瘤和自身免疫病发生发展中的功能研究进展进行简要概述，以期为特异性靶向巨噬细胞的创新诊断和治疗策略提供新视角和新途径。

1 组织定居巨噬细胞的起源

van Furth曾提出组织定居巨噬细胞来源于成体血液循环中的单核细胞[5]。但随着实验方法和技术的不断发展，研究者们对巨噬细胞起源的认识也在不断拓展。目前已知单核细胞并不是组织定居巨噬细胞的唯一来源，并且胚胎期和出生后成体内的巨噬细胞具有不同的起源途径[6](图1)。

1.1胚胎期巨噬细胞的来源 随着谱系示踪技术的发展，现有的研究在完善单核吞噬细胞系统(MPS)的基础上，发现在个体发育的不同阶段，巨噬细胞的来源有所不同，主要包括以下三种不同来源：卵黄囊巨噬细胞，胎肝单核细胞和骨髓单核细胞[7]，其中卵黄囊和胎肝(Fetal liver,FL)是胚胎期巨噬细胞来源的主要场所。在Hoeffel团队研究的巨噬细胞起源模型中，巨噬细胞的前体细胞最早出现在小鼠胚胎7.25 d(Embryonic day 7.25，E7.25)的卵黄囊血岛(后板中胚层)中，E7.5产生第一波红系-髓系前体细胞(Erythro-myeloid precursors，EMPs)，其表达集落刺激因子-1受体(Colony stimulating factor 1 receptor，CSF-1R)，并通过该受体进行信号传导从而维持前体细胞的生存和分化[8]。随后EMPs不经过单核细胞中间体而直接分化为原始成红细胞、巨核细胞和巨噬细胞。此时的巨噬细胞缺乏可检测的吞噬活性，具有F4/80(成熟巨噬细胞标志)的微弱免疫反应性，属于未成熟的巨噬细胞[9]。在E9.5，卵黄囊巨噬细胞开始以球形为特征通过血液渗入胚胎，随着越来越多的树突形成，巨噬细胞失去血管内转运能力，最后在定居的组织内发育为表型成熟的巨噬细胞[10,11]。这个过程的个体发育伴随造血系统的发生发展，又称为初级造血。在众多组织定居巨噬细胞中，小胶质细胞，部分朗格汉斯细胞和库普弗细胞都来源于这个过程[12]。

初级造血十分短暂，很快被次级造血取代。卵黄囊的生血内皮在E8.5左右产生第二波EMPs，这部分前体细胞表达较高水平的c-Myb，而不依赖于CSF-1R[6,8]。随后EMPs迁移到胎肝，并在其中增殖并分化为红细胞、单核细胞和粒细胞等多个谱系细胞[13]。此时的胎肝单核细胞具有较高的增殖潜力，很少表达与病原体识别和免疫激活有关的基因。在E13.5-14.5，胎肝单核细胞受到质膜囊泡相关蛋白(Plasmalemma vesicle associated protein，PLVAP)的调控释放进入血液，并定植于脑以外的其他组织[14]。在卵黄囊巨噬细胞耗竭的情况下，胎肝单核细胞能够作为补偿机制产生小胶质细胞[15]。随着E8.5晚期EMPs的出现， 在胚内生血内皮中又产生新一波造血祖细胞，在E10.5的主动脉-性腺-中肾(Aorta-gonad-mesonephros，AGM)区域中分化为非成熟的胚胎造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)，然后这部分细胞在胎肝中定植并建立确定的造血功能[16]。胚胎HSCs也可能对组织定居巨噬细胞有贡献，但这种贡献的程度和时间有待进一步研究[17]。

图1 组织定居巨噬细胞的起源Fig.1 Origin of tissue-resident macrophagesNote: Tissue-resident macrophages arise from three successive waves of hematopoiesis.(1) Early CSF-1R+ EMPs give rise to YS macroph-ages (without monocytic intermediate) from E7.5,then YS macrophages mature in specific tissues such as microglia.(2) Late c-Myb+ EMPs give rise to fetal monocytes in fetal liver from E8.5,then fetal monocytes migrate to special tissue to differentiate into mature macrophages.Although HSCs migrate to fetal liver,their function is poorly characterized.(3) After birth,GMPs and MDPs are thought to derive from CMPs and HSCs.GMPs and MDPs (with cMoPs intermediate) produce both Ly6C+ and Ly6C- monocytes.Finally,Circulating Ly6C+ monocytes are recruited and differentiated into tissue macrophages.

1.2出生后巨噬细胞的来源 当机体处于稳态时，胚胎源性的巨噬细胞在成体组织中不断进行自我更新和维持。然而，在感染和组织损伤造成组织定居巨噬细胞大量消耗的情况下，可以募集血液循环的单核细胞用于组织定居巨噬细胞的长期重建[18]。一旦成体造血开始发生在产生单核细胞的骨髓中，某些组织，例如真皮，心脏腹膜和肠，继续募集成体单核细胞以产生常驻巨噬细胞并随时间取代胚胎源性的巨噬细胞[6]。此前研究提示：髓系祖细胞(Common myeloid progenitors，CMPs)，粒系-单核系祖细胞(Granulocyte-monocyte progenitors，GMPs)，巨噬系和树突系祖细胞(Macrophage and DC progenitors，MDPs)从骨髓的HSCs以CMP-GMP-MDP模型连续产生单核细胞[19]。Yáez团队发现小鼠MDP独立于GMPs而来自CMPs，并且GMPs和MDPs都产生Ly6C+(经典单核细胞)和Ly6C-(非经典单核细胞)单核细胞亚群[20]。两种单核细胞亚群具有不同的功能，Ly6C+单核细胞半衰期短，可以迅速募集到炎症和组织重塑部位并且产生血液单核细胞衍生的巨噬细胞，这就是MPS模型涉及的巨噬细胞来源。而Ly6C-单核细胞被认为是“常驻血液巨噬细胞”，在血管内巡逻和清除受损内皮细胞，以维持血管完整性。Ly6C+单核细胞在没有炎症的情况下不会分化成组织巨噬细胞，而是在血液中连续产生Ly6C-非经典单核细胞[21]。此外，外周血中循环的早期pro-B细胞(携带非重排B细胞受体)在体内稳态维持过程以及炎症反应期间也参与形成组织定居细胞的过程[22]。

研究表明：卵黄囊巨噬细胞，胎肝和骨髓单核细胞等单独转移都可以稳定地定居在肺泡壁上并分化成相同功能和自我更新的肺泡巨噬细胞。但巨噬细胞的来源并不是巨噬细胞稳定占据特定生态位并执行组织特异性功能的决定性因素。在稳态条件下，组织微环境很大程度决定了肺泡巨噬细胞的转录[7,23]。而在免疫应激条件下，巨噬细胞的不同起源是否反映了不同的功能要求？此前的研究认为胚胎巨噬细胞主要促进组织重塑，而骨髓来源巨噬细胞则主要参与宿主的免疫防御[24]，但对于该观点还需进一步的研究验证。

2 组织定居巨噬细胞的异质性和可塑性

巨噬细胞是异质细胞类型最多的免疫细胞之一，其功能和表型的异质性和可塑性受组织微环境和外源性刺激(感染，炎症，损伤等)所调控。巨噬细胞分化以后既可以在特定组织中维持特异性的基因转录谱，还可以随时改变其活化状态以应对多重刺激。

2.1巨噬细胞的极化 成熟的巨噬细胞可以响应环境信号而发生极化(或活化)，这种极化形态有别于巨噬细胞不可逆的组织特异性表型，可以受到多种细胞因子或转录因子(包括STAT1、STAT6、C/EBPβ、IRF-4、IRF5和PPARγ等)的可逆调控[25,26]。最初发现的两种极化巨噬细胞分别是经典活化巨噬细胞(M1型巨噬细胞)和替代性活化巨噬细胞(M2型巨噬细胞)，分别由LPS、IFN-γ和IL-4等不同刺激诱导[27]。M1型巨噬细胞的特征主要包括：高水平的促炎细胞因子的表达，Th1应答的增强以及较强的杀病原菌和杀肿瘤活性。相反，M2型巨噬细胞被认为具有免疫调节作用，发挥抑制寄生虫，促进组织重塑和肿瘤发展等作用[28]。现有的研究还发现许多其他极化状态的巨噬细胞，例如，M2样的表型还可以细分为M2a(由IL-4或IL-13诱导)，M2b(由IL-10诱导)和M2c(由免疫复合物和LPS的组合诱导)型巨噬细胞[29]。不同的表型对应不同的功能，M2a促进Th2型炎症从而对抗纤维化和刺激伤口愈合，M2b型抑制炎性细胞因子并且涉及淋巴细胞的活化。M2c型主要负责免疫调节的失活[30,31]。最近研究发现新的区别于M1和M2样的M4型巨噬细胞，这类细胞由CXCL4诱导形成，并且高表达动脉粥样硬化相关的基因，可能与斑块不稳定和麻风结节的形成有关[32-34]。

M1和M2型巨噬细胞不能简单地进行二元区别，需要在不同的病理条件下进行深入分析。例如，在肿瘤和炎症消退等复杂过程中，巨噬细胞同时暴露于促炎信号和抗炎信号，从而伴随混杂的M1和M2型巨噬细胞的产生。此外，M2型巨噬细胞暴露于M1型微环境中，或反之，还可以诱导已极化的巨噬细胞“再极化”[35]。结肠巨噬细胞因其菌群共生的特异微环境，在静息状态就处于表达CD206和CD163并分泌IL-10细胞因子的M2型抗炎表型[36]。目前，M1/M2概念被认为主要适用于骨髓来源巨噬细胞的炎症反应，而对于特异来源于卵黄囊巨噬细胞的小胶质细胞，是否也存在M1/M2型极化仍然存在争议[37]。

2.2巨噬细胞的特殊形态 细胞内脂质和代谢物的稳态失衡会影响巨噬细胞的表型和功能。血清中低密度脂蛋白(Low density lipoproteins，LDL)颗粒的流入和流出之间的平衡失调会促使巨噬细胞转化为泡沫细胞[38]。在正常情况下，巨噬细胞通过ATP结合转运子将高密度脂蛋白(High density lipoproteins，HDL)分泌到血清中，来输出滞留在细胞质内的胆固醇。而在动脉粥样硬化等慢性炎症性疾病以及结核分枝杆菌等病原导致的慢性感染过程中，炎症刺激可导致胆固醇在巨噬细胞内积聚，进而诱发泡沫细胞的形成[39，40]。泡沫巨噬细胞是炎症反应的产物，不仅能发挥促炎功能，还可以通过前列腺素E和白三烯来增强炎症反应。ATP Binding Cassette Transporter G1(ABCG1)缺陷小鼠(胆固醇输出功能受损的缺陷小鼠)可通过增加泡沫性巨噬细胞的产生进而诱发肺部炎症的增强[41]。此外，结核肉芽肿和动脉粥样硬化斑块等病理组织中的巨噬细胞还可以形成多核巨细胞、上皮细胞样巨噬细胞等特殊形态的巨噬细胞，它们的具体作用及机制有待进一步探明。调控巨噬细胞的极化状态或抑制病理性巨噬细胞的形成，将有助于缓解慢性炎症并改善临床症状。

3 组织定居巨噬细胞与疾病

组织定居巨噬细胞在静息状态时主要发挥吞噬功能，而在感染或组织受损时，则可迅速增殖或从血液中的单核细胞进行补充进而激发炎症免疫反应，发挥抗感染功能。此外，组织定居巨噬细胞还参与免疫稳态调控并与肿瘤和自身免疫病密切相关[36,42](图2)。

3.1感染性疾病 巨噬细胞极化是一个受到严格控制的过程，需要一系列信号通路、转录和转录后调控网络的维持。局部组织微环境中的某些因子(如亚铁血红素、视黄酸等)可诱导组织特异性转录因子的表达和活化，并进而调控特定细胞亚群的转录程序[43]。此外，组织定居巨噬细胞表面可表达多种识别病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的受体，包括Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)、寡核苷酸结合结构域(Nucleotide-binding oligomerization domain，NOD)样受体(NOD-like receptor，NLR)、凝集素(Lectin)和清道夫受体(Scavenger receptor，SR)等[44]。各种受体在不同组织中的表达和功能的异质性也导致不同组织定居巨噬细胞可被不同微生物激活而产生不同的极化状态。巨噬细胞M1-M2极化的不平衡通常与各种感染性疾病和炎症反应结局密切相关。例如：在单核增生李斯特菌[45]和伤寒沙门氏菌感染时[46]，巨噬细胞主要呈现M1型的杀菌状态。而在寄生虫感染过程中，巨噬细胞通常会进行M2极化的动态转换[47]。在新生隐球菌感染数周内巨噬细胞从IL-4主导的反应变为IFN主导，极化状态总体从M2型变为M1型，从而促进机体的杀菌作用[48]。在沙门氏菌感染过程中，含有非生长沙门氏菌的巨噬细胞显示出M1极化状态，而含有生长细菌的巨噬细胞则变成了类似M2的抑炎状态，因此病原菌可通过对巨噬细胞极化的重编程来克服宿主防御，从而将宿主微环境改造成有利于自身生存的环境[49]。巨噬细胞是结核分枝杆菌感染的主要细胞类型。在结核性肉芽肿中，M1型巨噬细胞的位置更靠近中心坏死区域，而M2型巨噬细胞则更靠近外周部分。巨噬细胞的极化状态与结核肉芽肿的转归密切相关，并且也是病原菌是否播散的重要原因之一[50]。

图2 组织定居巨噬细胞与疾病Fig.2 Tissue-resident macrophages and human diseasesNote: Tissue-resident macrophages play a pivotal role in the maintenance of immune homeostasis.When the homeostasis breaks down,tissue-resident macrophages affect the development of multiple diseases.In infectious diseases,macrophages acquire different active status (M1 or M2) and adaptive programs (tolerance or trained immunity) when infected with different pathogens.In tumor,TAMs (Tumor-associated macrophages) translate into M2-like macrophages and secrete anti-inflammatory cytokines (IL-10,TGF-β) and Cathepsin B,MMPs,vascular endothelial growth factors to promotes tumor growth.In autoimmune diseases,macrophages with impaired phagocytosis translate into M1 macrophages and promote the secretion of various cytokines,such as TNF-α,IL-1β,etc.

病原菌的成分，如脂多糖(LPS)和β-葡聚糖(β-glucan)，可在适当条件下分别导致免疫耐受(Tolerance)和驯化免疫(Trained immunity)。由LPS等导致的免疫耐受即免疫抑制表型，这类巨噬细胞与M2型巨噬细胞表达的转录谱相似，例如IL-10、Arg-1、趋化因子CCL17和CCL22的表达升高，并对后续刺激反应迟钝。免疫耐受性并不是一种无应答的形式，而是巨噬细胞功能对组织修复和免疫调节表型重新定向的适应性反应[51,52]。与之相反，由β-glucan等诱导的驯化免疫则是指初始感染刺激可以增强巨噬细胞第二次杀灭病原菌的能力，驯化记忆不依赖于适应性免疫，持续时间比较短。免疫耐受和驯化免疫主要受H3K4me3、H2K27Ac、H3K9me2等表观修饰重编程机制的调控[53]。训练有素的免疫程序导致的适应状态可以在微生物定植或感染后更好地保护宿主，然而当不适应状态出现就会引发免疫麻痹等现象[54]。

3.2肿瘤 原癌基因和抑癌基因的异常或慢性炎症性疾病可以促进肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)的形成。研究发现肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAM)是肿瘤炎性反应的重要驱动因素。血液循环Ly6C+单核细胞和单核细胞相关的髓样抑制细胞(Monocytic myeloid-derived suppressor cells，M-MDSCs)可以响应多种趋化因子、集落刺激因子和血管内皮生长因子而被募集到肿瘤中，并依赖于RBPJ(Notch信号传导的转录调节因子)分化成TAM，但是在胶质瘤中，TAM由小胶质细胞、血液循环单核细胞和单核细胞的混合细胞群构成。巨噬细胞的不同个体起源是否有助于肿瘤的发生，仍然是个悬而未决的问题。不过免疫抑制表型的TAM极化似乎是大多数癌症的共同特征，高频率出现的TAM通常与大多数人类癌症的不良预后相关[55]。

在一些肿瘤中，TAM因其强大的可塑性可以发生原位增殖，并且可获得M2样巨噬细胞的特性和表型[56,57]。一方面，TAM可释放多种蛋白水解分子，如纤溶酶、Cathepsin B、基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)和非蛋白水解分子。在乳腺癌的小鼠模型中，IL-4诱导巨噬细胞中Cathepsin B的上调，以促进肺部肿瘤转移[58]。另一方面，在肿瘤微环境中，低氧张力可增加HIF-1和HIF-2的表达，导致VEGF、CXCL8/IL-8和糖酵解酶的高表达水平，进而引发巨噬细胞中的促血管生成程序[59]。此外，在局部缺氧期间，肿瘤微环境中的腺苷水平升高也有助于巨噬细胞释放血管生成因子和淋巴管生成因子[60]。TAM还可以通过双向相互作用促进调节性T(Regulatory cells，Treg)细胞的免疫抑制活性，并且产生免疫抑制细胞因子(如IL-10和TGFβ)，PDL1和PDL2(它们可以触发T细胞中抑制性PD1介导的免疫检查点)，进一步导致免疫抑制[61]。在个性化医疗中，TAM可以作为工具来定制细胞减灭疗法和免疫疗法，并且以TAM为靶点的治疗策略可以发挥与化疗和免疫疗法互补和协同的作用。

3.3自身免疫病 巨噬细胞功能的损伤可引起多种自身免疫病(Autoimmune disease，AD)和炎性疾病的产生。一旦机体出现炎症，巨噬细胞招募活化的中性粒细胞和单核细胞进入炎症部位，活化的中性粒细胞在激活后几小时内发生组成型凋亡。随后，巨噬细胞识别和吞噬凋亡及坏死的细胞[62]。在摄入凋亡细胞后，巨噬细胞积极地产生抗炎介质，例如TGF-β、PGE2和IL-10。然而，在风湿性关节炎和系统性红斑狼疮中，巨噬细胞的胞葬作用瘫痪，不能有效清除垂死细胞，因而导致炎症进一步加重[63,64]。巨噬细胞持续活化也会导致免疫稳态失衡，其引发的细胞因子风暴使得促炎细胞因子水平(IL-1、IL-1β、IL-18、TNF-α)显著增加。已有研究提示NLRC4活性突变引起巨噬细胞持续性激活，从而促进IL-1β和IL-18的过量产生以及焦亡发生，并进一步诱发自身免疫病[65,66]。巨噬细胞极化的紊乱是引起自身免疫病的重要因素，M1巨噬细胞的几种标志物(TNF-α、IL-6、IL-10和IFNs)已被鉴定为多种慢性炎症和自身免疫疾病的重要介质，包括克罗恩病、类风湿性关节炎和多发性硬化症[67,68]。此外，M1巨噬细胞侵入肠组织直接导致紧密连接蛋白的失调和上皮细胞的凋亡，从而破坏上皮屏障，最终驱动炎症性肠炎(Inflammatory bowel disease，IBD)的发生[68]。

4 展望

综上所述，巨噬细胞调节免疫稳态的终末状态由其起源、组织微环境、外源刺激等因素综合决定。确定组织定居巨噬细胞的起源和发育途径有助于解析其在各种疾病发生发展过程中的作用，并据此设计针对巨噬细胞的新疗法。但目前对于组织定居巨噬细胞的起源和发育模型仍然有许多争议，并且其功能和表型异质性的分子调控机制也远未阐明。例如，不同来源的巨噬细胞维持免疫稳态的作用是否有差异？其调控肿瘤发生发展的作用是否不同？随着机体的生长，组织定居巨噬细胞大多已被骨髓来源巨噬细胞取代，理解生态位在组织定居巨噬细胞异质性形成和维持中的作用也显得尤为关键[69]。鉴于TAM在肿瘤中的重要作用，以巨噬细胞为中心的抗癌治疗方法正在研发中[56,70]。那么如何改变巨噬细胞活化状态才有助于治疗感染性疾病和自身免疫病？对此我们还需进一步的深入探寻，尤其是借助新技术手段如应用单细胞测序和结合高分辨率的深度表型分析方法，仔细分析具有不同表型的共存细胞群在特定的感染及自身免疫性疾病发生发展进程中的动态相互作用及精细调控机制，并系统分析这些细胞群的分子网络，从而为靶向特定巨噬细胞亚群的治疗方法提供更精确的线索和靶标。