虎杖甙对人乳腺细胞系MDA-MB-231增殖、侵袭和迁移的调节作用①

冯传波 邵 华 王钟林 朱双九 郑新闻

(连云港市第二人民医院甲乳外科，连云港 222006)

乳腺癌是女性最常见的肿瘤之一，是导致女性癌症死亡的首要原因[1]。据报道，全球每年乳腺癌的新发病例约有1 400 000人，约有450 000人死于乳腺癌[2]。乳腺癌好发于发达国家，但由于医疗资源的限制，约有60%的乳腺癌死亡发生在发展中国家[3]。近年来，靶向治疗等新型治疗方法的发展使乳腺癌的致死率有所降低，但仍不足以治愈乳腺癌[4]。大多数乳腺癌患者在确诊时已经出现癌症的系统转移，大大增加了乳腺癌患者的死亡率[5]。因此，寻找抑制癌细胞转移的方法可能有利于降低乳腺癌的致死率。现代研究表明，天然药物在抑制癌症复发和癌细胞转移方面具有一定的优势，与现代化疗药物比较还具有低毒副作用的特点[6]，因此成为近年来抗癌药物研究的热点。虎杖是我国传统中药，其主要有效成分虎杖甙(Polydatin)对休克、缺血损伤、充血性休克及子宫内膜异位等疾病具有明显的疗效，同时还能减缓一些癌症的发展[7]。Chen等[8]研究表明，虎杖甙也能诱导乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞凋亡，但关于虎杖甙对乳腺癌细胞侵袭及迁移的作用还未见报道。本研究采用不同浓度虎杖甙处理乳腺癌MDA-MB-231细胞，以探究虎杖甙对乳腺癌细胞侵袭及迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1材料 虎杖甙购自美国Sigma公司，DMEM细胞培养液、特级胎牛血清和胰蛋白酶购自美国Thermo Fisher公司，CCK8试剂盒和BCA试剂盒购自美国Bio-Rad公司，Matrigel胶及Transwell小室购自美国Millipore公司，Ki67、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)一抗购自英国Abcam公司，HRP偶联的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗购自北京中杉生物公司，HE染色剂购自北京博奥森公司，ECL试剂盒购自广州吉赛生物有限公司。

1.2方法

1.2.1试剂配置 精密称取适量虎杖甙用微量的二甲基亚砜溶解，溶解后加入无血清培养液配置为100 μmol/L的虎杖甙储存液，经过滤除菌后，密封保存于-20℃冰箱，临用前用完全培养液稀释到实验所需浓度后备用。

1.2.2细胞培养及分组 乳腺癌细胞系MDA-MB-231购自美国ATCC公司。用含有10%胎牛血清的DMEM培养液将细胞培养于37℃、5%CO2的细胞培养箱中，隔天换液，2～3 d传代一次。

将MDA-MB-231细胞分为MDA-MB-231组、Polydatin(0.2 μmol/L)组、Polydatin(0.5 μmol/L)组和Polydatin(1 μmol/L)组，并分别用0、0.2、0.5和1 μmol/L的虎杖甙处理MDA-MB-231细胞，根据实验设计进行对应后续检测。

1.2.3CCK8检测细胞活性 将MDA-MB-231细胞接种于96孔板中，种板密度为5×104个/ml。用0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20和50 μmol/L的虎杖甙处理细胞，每个浓度6个复孔。24 h后根据CCK8试剂盒说明书检测各组细胞的细胞活性。

将细胞接种于96孔板中，分为MDA-MB-231组、Polydatin(0.2 μmol/L)组、Polydatin(0.5 μmol/L)组和Polydatin(1 μmol/L)组，并用不同浓度的虎杖甙分别处理0、1、2、3和4 d，根据CCK8试剂盒说明书检测各组细胞活性。

1.2.4Transwell检测细胞侵袭能力 将Matrigel提前放于4℃冰箱中，待Matrigel溶化后取出，迅速加入到Transwell小室内，以盖住小室底部为宜，并保证无气泡产生。将加有Matrigel的Transwell小室放入培养箱中，待Matrigel凝固后取出备用。将MDA-MB-231细胞以1×105个/ml的密度接种于Transwell小室内，上层分别加入含有不同浓度虎杖甙的无血清培养液，下层则加入正常培养液。24 h后用无菌棉签擦去上层未迁移蛋白，用HE将下层迁移细胞染色并计数。

1.2.5划痕实验检测细胞迁移能力 用无菌maker笔于6孔板背面划平行直线，使每个培养孔背面至少有5条平行直线。将MDA-MB-231细胞接种于6孔板内，细胞密度为1×105个/ml。待细胞贴壁后，用10 μl的枪头垂直于培养板背面直线划痕，用磷酸盐缓冲液洗去被划下的细胞，将细胞分为MDA-MB-231组、Polydatin(0.2 μmol/L)组、Polydatin(0.5 μmol/L)组和Polydatin(1 μmol/L)组，并按照1.2.2所描述的方法处理24 h并记录 0 h 和24 h时各组细胞的划痕宽度，计算细胞划痕闭合率。

1.2.6免疫印迹检测蛋白表达 将细胞按照1.2.2描述方法处理24 h后，用RIPA裂解液提取各组细胞蛋白，用BCA试剂盒检测蛋白质浓度并调平蛋白质浓度。每组分别取30 μg蛋白用10%的SDS-PAGE分离蛋白并用半干法将蛋白质转移到PVDF膜，用5%的脱脂奶粉溶液室温封闭膜2 h，随后加入适宜浓度一抗，4℃孵育过夜。第二天用缓冲液洗去多余一抗，加入二抗室温孵育1 h后，滴加化学发光显色液于暗室曝光显影。

2 结果

2.1虎杖甙对MDA-MB-231细胞增殖的影响 如图1 所示，当虎杖甙浓度为2 μmol/L时，MDA-MB-231细胞的细胞活性明显降至80%以下，并随虎杖甙浓度升高，细胞活性逐渐降低。因此，选择0.2、0.5和1 μmol/L三个对MDA-MB-231细胞无明显细胞毒性的浓度进行后续实验。用虎杖甙处理MDA-MB-231不同时间后发现，虎杖甙处理细胞4 d后，MDA-MB-231细胞增殖倍数显著降低，与MDA-MB-231组比较差异有统计学意义(P<0.01,图2)。此外，与MDA-MB-231组比较，Polydatin(0.2 μmol/L)组、Polydatin(0.5 μmol/L)组和Polydatin(1 μmol/L)组细胞增殖相关蛋白Ki67的蛋白表达水平显著降低(P<0.01,图3)，并体现出量效关系，表明虎杖甙能抑制MDA-MB-231细胞增殖。

2.2虎杖甙对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响 与MDA-MB-231组比较，Polydatin(0.2 μmol/L)组、Polydatin(0.5 μmol/L)组和Polydatin(1 μmol/L)组侵袭细胞数量显著减少(P<0.01,图4)，差异具有统计学意义，表明虎杖甙能抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭。

图1 不同浓度虎杖甙对MDA-MB-231细胞活性的影响Fig.1 Effect of different concentration of polydatin on cell viability of MDA-MB-231 cells

图2 虎杖甙对MDA-MB-231细胞增殖倍数的影响Fig.2 Effect of polydatin on cell growth folds of MDA-MB-231 cellsNote：n=6,**.P<0.01 vs MDA-MB-231 group.

图3 虎杖甙对Ki67、VEGF和MMP-9蛋白表达的影响Fig.3 Effect of polydatin on expression of Ki67,VEGF and MMP-9Note：n=6,**.P<0.01 vs MDA-MB-231 group.

2.3虎杖甙对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响 划痕实验结果表明，与MDA-MB-231组比较，Polydatin(0.2 μmol/L)组、Polydatin(0.5 μmol/L)组和Polydatin(1 μmol/L)组细胞划痕闭合率显著降低(P<0.01,图5)，差异有统计学意义，并具有量效关系。同时,Polydatin(0.2 μmol/L)组、Polydatin(0.5 μmol/L) 组和Polydatin(1 μmol/L)组细胞侵袭和迁移相关蛋白VEGF和MMP-9的蛋白表达水平显著降低(P<0.01,图3)，与MDA-MB-231组比较差异有统计学意义，表明虎杖甙能抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭和迁移。

图4 虎杖甙对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响Fig.4 Effect of polydatin on invasion ability of MDA-MB-231 cellsNote：n=6,**.P<0.01 vs MDA-MB-231 group.

图5 虎杖甙对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响Fig.5 Effect of polydatin on migration ability of MDA-MB-231 cellsNote：n=6,**.P<0.01 vs MDA-MB-231 group.

3 讨论

虎杖是我国传统中药，在我国已有上千年的用药历史，并已被列入我国药典[9]。虎杖甙，又称为白藜芦醇苷，是虎杖的主要有效成分，虎杖甙常被用于慢性支气管炎、肝炎、休克的治疗，具有明显的心血管系统保护作用[10]。研究表明，虎杖甙可由白藜芦醇衍生而来，因此与白藜芦醇有着多种相似的药理学活性，并且虎杖甙更易被机体吸收、具有更强的抗氧化活性[10]。白藜芦醇对多种癌细胞的增殖、侵袭及迁移具有明显的抑制作用[11]。近年来也有研究发现，虎杖甙也能诱导宫颈癌、结肠癌及卵巢癌等多种癌细胞凋亡[12-14]。同时，虎杖甙还能诱导MDA-MB-231细胞凋亡[11]。但虎杖甙是否能影响MDA-MB-231细胞的侵袭和迁移能力还未见报道。Jiao等[15]研究发现，虎杖甙还能抑制肝癌HepG2细胞增殖、侵袭及迁移，还能通过抑制磷酸戊糖途径抑制小鼠头颈部鳞状细胞癌的转移，提示其也能影响癌细胞侵袭和迁移的能力[16]。为了探究虎杖甙对乳腺癌细胞增殖、侵袭及迁移的作用，本研究首先采用多浓度的虎杖甙处理MDA-MB-231细胞并发现虎杖甙浓度达到2 μmol/L时能使MDA-MB-231细胞活性降至80%以下，表明虎杖甙浓度达到2 μmol/L 时对MDA-MB-231细胞具有明显的细胞毒性，并且随虎杖甙浓度的升高，细胞毒性逐渐增强。因此，本研究选择0.2、0.5和1 μmol/L三个浓度进行后续实验。用虎杖甙处理MDA-MB-231细胞4 d后，MDA-MB-231细胞的增殖速度显著降低，并且具有剂量依赖性。同时，虎杖甙还能显著抑制细胞增殖相关蛋白Ki67蛋白表达，提示虎杖甙能抑制MDA-MB-231细胞增殖，与之前的研究报道一致[11]。

癌症转移涉及多个病理学过程，包括肿瘤细胞的分离、转移、黏附和侵袭进入血液或淋巴管[17]。其中，癌细胞的侵袭和转移是导致癌症转移的主要原因[18]。本研究采用Transwell实验和划痕实验检测虎杖甙对MDA-MB-231细胞侵袭和迁移能力的影响发现，虎杖甙能显著减少侵袭的乳腺癌细胞数量并降低MDA-MB-231细胞的划痕闭合率，同时体现量效关系，表明虎杖甙可降低MDA-MB-231细胞的侵袭和迁移能力。癌细胞的侵袭和转移是由多个细胞因子共同调控的过程， MMP家族在癌细胞转移到靶向组织的过程中发挥了重要作用，其中以MMP-9最为重要[19]。MMP-9能够降解Ⅳ胶原酶，在乳腺癌中呈高表达状态，并与乳腺癌患者的预后有关[5]。抑制MMP-9的表达能抑制乳腺癌细胞的转移，有利于乳腺癌的治疗[20]。本文研究结果表明，虎杖甙能显著抑制MDA-MB-231细胞中MMP-9的表达，并具有量效关系，同时还能显著抑制VEGF的表达。研究表明，VEGF在癌症转移的过程中也具有重要作用，能通过促进细胞外基质的降解、增大血管通透性促进癌细胞的侵袭和迁移[21]。结合实验结果进一步表明，虎杖甙能抑制MDA-MB-231细胞侵袭和转移。

综上所述，虎杖甙能降低MDA-MB-231细胞的生长倍数和增殖相关蛋白Ki67的表达，同时还能减少MDA-MB-231细胞的侵袭，降低细胞划痕闭合率，此外还能降低侵袭和迁移相关蛋白MMP-9和VEGF的表达，表明虎杖甙能抑制MDA-MB-231细胞增殖、侵袭和迁移。本研究首次探究了虎杖甙对MDA-MB-231细胞侵袭和迁移能力的影响，但关于具体作用机制的探究还比较欠缺，因此实验室后期将进一步探究虎杖甙抑制MDA-MB-231细胞侵袭和迁移的作用机制。