虫草素对胶质瘤细胞的增殖及侵袭作用的影响及机制研究①

杨 刚 张永红 郑茂华

(兰州大学第一医院神经外科，兰州 730000)

神经胶质瘤是一种最常见的神经系统恶性肿瘤，可分为Ⅰ～Ⅳ级，级别越高，预后越差[1]。虫草素(Cordycepin，Cor)是腺苷类似物，属核苷类新药。近些年来，虫草素的药用价值逐渐被人们所发现，已成为当前科学研究的热点之一[2]。虫草素具有抗肿瘤、抗菌消炎和清除自由基等多种药理作用。研究发现，虫草素不仅可抑制肾癌和肺癌等多种肿瘤细胞RNA和DNA合成，还可诱导细胞凋亡而发挥抑制肿瘤的作用，但尚未明确抗肿瘤的具体机制[3，4]。因此，本研究使用虫草素作用神经胶质瘤U87细胞，探讨其对细胞增殖和侵袭的作用。

1 材料与方法

1.1材料 神经胶质瘤U87细胞，购自中科院上海细胞研究所，由本实验室冻存；虫草素购自大连美仑生物技术有限公司；CCK8试剂盒购自北京智杰方远科技有限公司；Corning Transwell小室购自上海子起生物科技有限公司；Trizol试剂购自上海名劲生物科技有限公司；EZBioscience逆转录试剂盒购自上海海方生物技术有限公司；SYBR Green荧光定量染料法试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；鼠抗人Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin和β-actin单克隆抗体均购自Abcam公司；引物合成上海英潍捷基有限公司；美国ABI梯度PCR仪购自上海奥陆生物科技有限公司；Berthold LB943多功能酶标仪购自上海伯托同位素技术服务中心；Bio-Rad CFX96 Real-time PCR仪购自上海易汇生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 使用Gibco高糖DMEM(10%胎牛血清)培养神经胶质瘤U87细胞，放置于37℃、5%CO2培养箱中培养。将对数生长期的U87细胞消化后制备细胞悬液，接种至6孔或96孔Corning细胞培养板，药物处理组加入不同浓度(100、200和400 μg/ml)虫草素，并设立对照组(不加虫草素，即药物浓度为0 μg/ml)，每个浓度设置3个复孔，每个时间设置3个复孔。

1.2.2细胞存活率测定 使用CCK8法测定细胞存活率。接种6×103个细胞到96孔Corning细胞培养板中，配制使用不同浓度虫草素(100、200和400 μg/ml)，并设立对照组(不加虫草素)，在培养箱中孵育1、2和3 d，加入100 μl配制好的CCK8(20 μl CCK8液+180 μl高糖DMEM培养基)，37℃继续培养孵育2 h，酶标仪测定OD450值。按以下公式计算细胞存活率=(对照组OD450-处理组OD450)/对照组OD450×100%。

1.2.3虫草素对细胞侵袭的影响 将Transwell小室放入细胞培养板中，上室加入300 μl高糖DMEM培养基，静置30 min，水化基质胶后，弃去培养基。接种100 μl，浓度为 3×105个/ml U87细胞液接种到上室中，下室中加入600 μl 20%FBS的高糖DMEM培养基，将其放置于5%CO2培养箱中培养24 h。取出Transwell培养板，弃掉上层液体，小心擦拭小室后倒扣于超净台中，室温放置5 min。弃去培养板孔内液体，使用磷酸缓冲液洗涤2遍后，用湿棉签擦净上室面的Matrigel基质胶和细胞。使用甲醛固定30 min，最后使用1%结晶紫染色18 min，磷酸缓冲液洗涤3遍。将培养板置于光学显微镜下，随机选取4个视野进行拍照并计数。

1.2.4虫草素对Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin蛋白水平的影响 使用Western blot法测定Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin 蛋白水平。胰酶将细胞消化下来，PBS洗涤1遍后，离心取细胞沉淀，使用蛋白裂解液提取细胞总蛋白。测定蛋白浓度并将蛋白浓度调整为1 mg/ml，进行蛋白电泳。电泳结束后进行转膜，封闭后孵育Cyclin D1或其他单克隆抗体，4℃过夜。使用配制的含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤3遍后孵育辣根过氧化物酶标记山羊抗人IgG，室温孵育2 h后，PBST洗涤3遍，进行ECL显色，曝光。使用Image J软件分析，以β-actin蛋白水平作为参照，计算Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin蛋白的相对表达水平。

1.2.5虫草素对Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin mRNA水平的影响 使用q-PCR法测定Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin mRNA水平。Trizol试剂提取细胞RNA，使用Nanodrop测定细胞RNA浓度并调整为1 μg/ml，依据逆转录试剂盒说明书操作，将总RNA逆转为cDNA。依据SYBR Green 荧光定量染料法试剂盒进行荧光定量PCR反应。Cyclin D1 F:5′-GTGCATCTACACCGACAACT-CCA-3′；R:5′-TGAGCTTGTTCACCAGGAGCA-3′；Bcl-2 F:5′-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3′；R:5′-TGCATATTTGTTTGGGGCAGG-3′；MMP-2 F:5′-TC-TAACGGTCGGGAAACA-3′；R:CCAACAGTGGACA-TAGCC；MMP-9 F:GAGATGCGTGGAGAGTCGA；R:CGAGTTGGAACCACGACGC；Ezrin F:5′-CCCTCCAGTTCAAGTTCC-3′，R:5′-AAGCCAAAGGTCTGT-TCC-3′；β-actin F:5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，R:5′-GCTGTCACCTTCACCGGTCC-3′。反应程序:95℃ 5 min；94℃ 50 s，59℃ 50 s，72℃ 60 s，40个循环；72℃，10 min。用ΔΔCt法，以β-actin mRNA水平作为参照，计算Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin mRNA的相对表达水平。

2 结果

2.1虫草素对U87细胞增殖的影响 100 μg/ml虫草素作用不同时间后对U87细胞增殖均无明显影响(P>0.05)。200、400 μg/ml虫草素作用后可明显抑制U87细胞的增殖，且随着药物浓度和作用时间上升，细胞存活率降低(P<0.05)，呈现剂量和时间依赖性，见图1。

图1 虫草素对U87细胞增殖的影响Fig.1 Effect of cordycepin on proliferation of U87 cellsNote: *.P<0.05 compared with 0 μg/ml drug;#.P<0.05 compared with 24 h.

图2 虫草素对U87细胞侵袭的影响Fig.2 Effect of cordycepin on invasion of U87 cellsNote: *.P<0.05 compared with 0 μg/ml drug.

2.2虫草素对U87细胞侵袭的影响 100 μg/ml虫草素对U87细胞侵袭无明显影响，发现200、400 μg/ml 虫草素可明显抑制U87细胞侵袭(P<0.05)，且呈剂量依赖性，见图2。

2.3虫草素对Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin蛋白水平的影响 结果显示，U87细胞经不同浓度虫草素(0、100、200、400 μg/m)处理24 h后，发现200和400 μg/ml处理后Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin蛋白水平明显降低(P<0.05)，100 μg/ml处理后对Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin蛋白的抑制作用不明显(P>0.05)，见图3。

2.4虫草素对Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin mRNA水平的影响 结果显示，U87细胞经不同浓度虫草素(0、100、200、400 μg/ml)处理24 h后，在200和400 μg/ml浓度时Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin mRNA水平明显降低(P<0.05)，100 μg/ml处理后对Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin mRNA的抑制作用不明显(P>0.05),见图4。

图3 虫草素对Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin蛋白水平的影响Fig.3 Effect of cordycepin on Cyclin D1，Bcl-2，MMP-2，MMP-9 and Ezrin protein levelsNote: *.P<0.05 compared with 0 μg/ml drug.

图4 虫草素对Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin mRNA水平的影响Fig.4 Effect of cordycepin on Cyclin D1，Bcl-2，MMP-2，MMP-9 and Ezrin mRNA levelsNote: *.P<0.05 compared with 0 μg/ml drug.

3 讨论

虫草素是第一个从真菌中分离出来的脱氧核苷类抗生素，在抗肿瘤方面具有较高的地位[5]。临床研究发现，以虫草素为主要活性成分的新药已试用于白血病的临床治疗[6]。近些年来，对虫草素的药理作用及生物活性研究较深入，已明确发现其具有抗肿瘤、抑制微生物生长、抗炎及免疫调节等功能。虫草素可明显抑制舌癌细胞、肝癌细胞生长，并且发现其机制与诱导细胞凋亡及抑制细胞转移有关[7，8]。本研究拟观察虫草素对神经胶质瘤U87细胞增殖和侵袭的作用并检测相关蛋白的表达，探讨虫草素对U87细胞的可能机制。

研究发现，虫草素可有效抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，可延缓肿瘤进展[9，10]。虫草素与腺苷的化学结构类似，可替代腺苷参与细胞代谢过程，抑制mRNA加尾，抑制肿瘤细胞的生长繁殖。另外，虫草素可促进细胞分化和T淋巴细胞转化，提高单核巨噬细胞的吞噬能力，直接杀伤肿瘤细胞。本研究结果发现，100 μg/ml虫草素作用不同时间后对U87细胞增殖均无明显影响(P>0.05)；200和400 μg/ml 浓度范围内作用后可明显抑制U87细胞的增殖，且随着药物浓度和作用时间上升，细胞存活率降低(P<0.05)，呈现剂量和时间依赖性，表明虫草素抑制U87的增殖，这与虫草素抗乳腺癌、肺癌和白血病等研究结果一致。进一步研究发现，100 μg/ml 虫草素对U87细胞侵袭无明显影响，200和400 μg/ml虫草素均可明显抑制U87细胞侵袭(P<0.05)，且呈剂量依赖性。结果表明，虫草素干预后，肿瘤细胞侵袭能力降低，进而抑制神经胶质瘤的发生发展，其机制可能是调控相关蛋白的表达。最近研究证明Ezrin、Bcl蛋白在乳腺癌等实体瘤进展中的增殖与转移过程中发挥重要作用[11，12]。Ezrin蛋白为膜-细胞骨架连接蛋白，其编码基因为微绒毛蛋白2，具有改变细胞运动的作用。Ezrin蛋白也与胶质瘤发生发展密切相关，Lou等[13]发现沉默Ezrin基因表达可显著抑制U87细胞浸润性生长，上调Ezrin表达可明显促进U87细胞迁移，下调其表达可抑制迁移。研究发现，MMP-2、MMP-9蛋白在乳腺癌、肝癌肿瘤细胞表达异常，其可促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移等[14-16]。刘正端等发现通幽汤通过下调 MMP-2、MMP-9等蛋白的表达，可抑制食管癌细胞的侵袭[15]。Cyclin D1在细胞周期的正常更替过程中起着关键调控作用，而细胞周期与肿瘤细胞生长具有密切联系。目前研究发现Cyclin D1在多种恶性肿瘤中异常高表达，可促进肿瘤细胞的增殖[17]。Bcl-2是细胞抑制凋亡因子，与肿瘤的进展密切相关。研究发现，其可通过抑制钙离子跨膜流动和抗氧化等发挥抗凋亡作用。有文献报道，虫草素可抑制舌癌细胞的增殖，其可能的原因是抑制Bcl-2蛋白的表达，进而促进肿瘤细胞的凋亡[18]。本研究结果发现，U87细胞经不同浓度虫草素(100、200、400 μg/ml)处理24 h后，在200和400 μg/ml浓度时Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin蛋白和mRNA水平明显降低，100 μg/ml处理后对Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ezrin蛋白和mRNA水平的抑制作用不明显，组间比较差异均具有统计学意义，与曾志青等[19]研究是一致的。推测其原因可能是:①虫草素能抑制EGF信号通路活化,下调 Ezrin的表达,同时抑制 MMP-2、MMP-9 的表达,进而抑制其向周围组织浸润和侵袭;②虫草素可延长G1/S期转换时间,降低细胞周期更替的速率,抑制细胞增殖;③抑制线粒体凋亡途径,下调Bcl-2表达,改变线粒体通透性,释放细胞色素C。

综上所述，虫草素能抑制U87细胞的增殖和侵袭，其机制可能与下调Ezrin、Bcl-2的表达有关。因此，深入开展虫草素抗肿瘤作用的研究，可为治疗神经胶质瘤带来新的理论依据。