超速离心法与QIAGEN膜亲和柱法提取前列腺癌细胞培养上清外泌体的方法学比较*

范维肖，刁艳君，马越云，郝晓柯

(空军军医大学西京医院检验科，西安 710032)

外泌体是直径为30～150 nm的具有脂质双层膜结构的一种细胞外囊泡，起源于细胞内的多囊泡体(MVB)[1]，MVB通过与细胞膜融合而后将外泌体释放到细胞外。外泌体可由多种细胞分泌并存在于诸如血液、尿液、乳汁以及胆汁等多种体液中，并且携带了宿主细胞来源的DNA，RNA和蛋白质等信息[2]，因此外泌体在细胞与微环境及远隔器官之间的交流中扮演着重要的角色[3]，而体液中的外泌体可以反映疾病的状况，许多研究都证实了外泌体携带的核酸、蛋白质以及脂质等都可以作为疾病诊断的标志物，因此外泌体也成为液体活检领域重要的三大方向之一[4-6]。

虽然外泌体的功能及临床应用已经被许多研究证实，但目前简便高效提纯外泌体的方法依然是外泌体研究的重要限速步骤，目前常用的提取方法有超速离心法、蔗糖密度梯度离心法、PEG沉淀法、磁珠法以及膜亲和柱法等[7-8]，超速离心法是外泌体提取的金标准，但超速离心法耗时耗力，并且提取率低；沉淀法虽然简单，但会同时沉淀许多杂蛋白，并且商品化试剂成本高；磁珠法适用于提取血液等起始量要求较低的生物样本来源的外泌体，用途有限；膜亲和柱法适用于提取包括细胞上清、血液及尿液等多种生物体液来源的外泌体，且操作相对简便。基于此，本研究通过常规的外泌体鉴定方法，对比了超速离心法和QIAGEN膜亲和柱法提取外泌体的特点，为外泌体的基础和临床研究提供方法学参考。

1材料与方法

1.1 细胞株来源 前列腺癌LNCaP-AI+F由浙江大学医学院第二附属医院陶志华教授馈赠；LNCaP-AI+F细胞用含10 g/dl炭处理血清的无酚红DMEM培养基培养在75 cm2的玻璃培养瓶中，待细胞生长至70%密度更换为含10 g/dl无外泌体血清的无酚红DMEM培养基继续培养48 h后收集细胞上清。

1.2 试剂和仪器 无酚红DMEM培养基购自吉诺生物，炭处理FBS购自BI公司，无外泌体血清购自上海逍鹏生物；CD63抗体购自Abcam，ALIX与EGFR抗体购自CST公司；BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司。超速离心法采用Beckman超高速离心机对细胞上清进行离心；QIAGEN膜亲和柱法所用试剂和柱子由QIAGEN公司提供，采用Beckman AllegraX-15R离心机离心。

1.3 方法

1.3.1 外泌体提取：超速离心法：按照THERY等[9]的文献报道，收集40 ml细胞上清，300 g离心10 min去除漂浮的细胞，弃沉淀吸取上清；2 000 g离心10 min去除死细胞，弃沉淀吸取上清；10 000 g离心30 min去除细胞碎片，弃沉淀吸取细胞上清；100 000 g离心70 min，所得沉淀为外泌体和杂蛋白；PBS清洗沉淀后继续再次100 000 g离心70 min，弃上清，用40 μl PBS重悬沉淀即为最终提取的外泌体。

QIAGEN膜亲和柱法：按照试剂盒说明书，收集40 ml细胞上清最终得到400 μl Buffer XE重悬的外泌体，而后将400μl外泌体加入100 kD超滤浓缩管12 000 r/min离心置换重悬液为PBS并浓缩外泌体至40 μl。

1.3.2 外泌体电镜鉴定：吸取10 μl外泌体样品滴于铜网，室温静置10 min；滤纸吸干铜网上的液体，滴加2 g/dl磷酸钨染液10 μl负染，室温静置5 min，滤纸吸去多余的液体，白炽灯下干燥后透射电镜下观察拍照。

1.3.3 BCA蛋白定量与外泌体纯度计算：收取LNCaP-AI+F细胞，300 g离心去除上清，100 μl细胞裂解液冰上裂解30 min，外泌体样品无需裂解。按照BCA蛋白定量试剂盒说明书配制蛋白标准品，而后蛋白标准品与细胞裂解及两种方法提取外泌体各取10 μl加入到96孔板，细胞裂解及外泌体设置三个复孔，加入200 μl工作液与样品37℃反应20 min后测得吸光度，绘制标准曲线计算出细胞裂解及两种方法提取外泌体浓度。

1.3.4 Western blot鉴定外泌体蛋白表达：根据BCA测得浓度，细胞裂解与超离及膜亲和柱法提取外泌体以15 μg的总蛋白量上样进行SDS-PAGE电泳，PVDF膜半干转印8 min，封闭液封闭1 h，分别与一抗摇床孵育2 h后4℃冰箱过夜。第二天回收一抗，TBS洗膜三次并与对应荧光二抗孵育1 h，之后TBS洗膜三次荧光扫描仪下扫膜观察条带并拍照记录。

2结果

2.1 电镜分析 图1A为超速离心法提取外泌体电镜图，图1B为膜亲和柱法所提取外泌体电镜图，两种方法均可在电镜下观察到外泌体结构，且直径均为100 nm左右，符合外泌体的粒径分布范围。超速离心法背景较为干净，杂质较少，而膜亲和柱法所得外泌体电镜下有类似蛋白聚合物等杂质存在。

A B

2.2 Western blot鉴定外泌体蛋白表达 实验中选取了外泌体的标志蛋白ALIX以及CD63，内参蛋白β-actin以及研究目的蛋白EGFR对两种方法所提取的外泌体蛋白表达进行了鉴定。图2所示，同等上样量，超速离心法外泌体ALIX和CD63均可见条带，而膜亲和柱法外泌体ALIX可见微弱条带，CD63无条带。超速离心外泌体β-actin与细胞裂解基本一致，而膜亲和柱法外泌体β-actin较细胞裂解弱，超速离心提取外泌体EGFR相对细胞裂解高表达，而膜亲和柱法提取外泌体这种富集的趋势并不明显。

2.3 Zetaview粒径分析 见图3A所示。超速离心外泌体粒径分布峰值为116 nm，图3B表明QIAGEN膜亲和柱法外泌体样本粒径分布峰值为

122 nm，两者粒径分布均符合外泌体粒径分布范围。

注：Cell lysate代表细胞裂解；Exo UC为超速离心法提取外泌体；Exo QIA为QIAGEN膜亲和柱法提取外泌体

图2两种方法提取外泌体标志蛋白及目的蛋白鉴定

A B

2.4 外泌体电势 外泌体电势分析表明超速离心法提取的外泌体电势为-23.46±2.38 mV：膜亲和柱法提取外泌体电势为-30.37±0.79 mV，较超速离心法提取外泌体电势更为偏负，差异有统计学意义(t=4.77，P<0.01)，两者均符合外泌体的电势分布范围[10-11]。电势越负，表明外泌体越稳定[12]，超速离心外泌体负值偏小可能与较高的离心力会影响外泌体的稳定性有关。

2.5 外泌体纯度 外泌体颗粒数与蛋白浓度的比值是用于评价外泌体纯度的一个指标，比值越高表明提取的外泌体越纯[7，13]。超速离心法提取的外泌体颗粒浓度与蛋白浓度比值为(9.7±1.2)×108particles/μg，高于QIAGEN膜亲和柱法的(6.5±1.4)×108particles/μg，差异有统计学意义(t=13.47，P<0.01)。

3讨论近年来越来越多的研究都证实了外泌体在细胞间通讯中扮演着重要的角色，特别是在肿瘤的发展过程中，肿瘤细胞来源的外泌体可通过多种信号通路赋予正常细胞、基质细胞及免疫细胞等相应的适于肿瘤生长的特性[14-15]。研究报道前列腺癌细胞来源的外泌体富集SRC，IGF-1R以及GRK等多种蛋白，可以激活细胞内的多种信号通路[16-17]，并且外泌体中的miRNA分子也已经被广泛报道可用于前列腺癌的临床诊断[18-19]，因此外泌体在前列腺癌的发病机制及液体活检中都具有重要的研究价值。

但在深入研究外泌体之前，如何从有限的生物样本高效可靠地分离提取外泌体仍然是一项挑战，超速离心法是目前提取的金标准，但超高速离心机繁琐的步骤和操作及其较低的提取率一定程度上对实验研究造成了限制，因此探索其它更快捷高效的提取方法可以为外泌体的后续内容物分析和功能研究奠定良好的基础。RICHARD等比较了超速离心法、沉淀法、超滤法和尺寸排阻法提取细胞上清外泌体的特点，发现超滤法和尺寸排阻法提取外泌体纯度与超速离心法相当，但超滤法大量浓缩细胞上清费时费力，简便性不及超速离心法，而尺寸排阻法单次可提取样本体积较小，不适用于需要大量外泌体的功能研究[7]；本研究通过电镜形态比较、Western blot蛋白鉴定、Zetaview颗粒浓度、粒径及电势分析以及纯度比较了超速离心法和QIAGEN膜亲和柱法提取前列腺癌细胞上清的特点，实验结果表明两种方法均可提取前列腺癌细胞上清的外泌体，超速离心法提取外泌体处理步骤繁琐，需要超速离心机，适合对外泌体纯度要求严格的实验，而QIAGEN膜亲和柱法纯度不及超速离心法，但可快速提取生物样本来源的外泌体，适用于核酸分析等实验。

外泌体重要的生物学功能使得对于基础研究和临床检测应用都具有重要的意义，因此选择合适的分离提取方法也成为外泌体研究的基础，本文从多个方面对比了目前常用的超速离心法和QIAGEN膜亲和柱法在提取细胞上清外泌体方面的优缺点，希望能为外泌体内容物分析和功能实验等相关研究提供参考和基础。