丙泊酚通过下调BNIPL-2抑制结肠癌增殖的研究

薛震宇 张磊 姜虹

结肠癌的发病率每年都在持续增加。2015年，结肠癌的发病率和死亡率在中国所有恶性肿瘤中排名第五［1］。结肠癌是全球癌症相关死亡的第四大原因，每年大约有140万的新发病例，并且2012年死亡人数将近70万［2］。虽然目前临床上已有的治疗手段包括手术、化疗和分子靶向治疗等，在一定程度上改善了患者的生活质量，但整体而言结肠癌患者的预后仍然较差［3］。因此，迫切需要开发更有效的治疗方法。

肿瘤细胞的迁移和侵袭在癌症转移中起关键作用。BNIPL-2（Bcl-2 /腺病毒E1B 19 kDa相互作用蛋白-2）可与Cdc42GAP相互作用并抑制Cdc42GAP 对Cdc42的GAP活性［4］。Rho家族的GTP酶Cdc42可以控制肌动蛋白细胞骨架的动力学［5-6］。细胞迁移与肌动蛋白细胞骨架的重组相关，并引发细胞形态的改变。说明BNIPL-2的过表达可能增加细胞侵袭并促进细胞迁移。

丙泊酚（2，6-二异丙基苯基）是麻醉诱导和维持期间广泛使用的药剂。最近的发现表明，麻醉可以在围手术期诱发代谢、炎症和免疫学变化［7］。最近已经揭示丙泊酚通过抑制细胞活力和癌细胞的侵袭能力对一些恶性肿瘤发挥抗肿瘤作用［8-9］。然而，其对癌细胞增殖的作用机制尚不清楚。因此，在本研究中，我们使用SW480结肠癌细胞研究了丙泊酚对癌细胞增殖作用的影响，并探讨了其潜在机制。

资料与方法

一、研究对象

应用TCGA分析BNIPL-2表达差异和相关基因转录组谱的临床结肠癌样本中BNIPL-2相关调控信号通路，来源于TCGA（http://cancergenome.nih.gov/）。

根据BNIPL-2的表达水平，对患者进行分组，分为高表达组和低表达组。为了检测临床恶性肿瘤阶段，相关信号传导，CRC患者存活率和BNIPL-2表达之间的关系，我们以BNIPL-2表达水平的中位数为分界线将CRC组织分为高表达组和低表达组。BNIPL-2表达高于中位数的患者被分为高表达组。BNIPL-2表达低于中位数的患者分为低表达组。

二、细胞实验

（一）细胞培养、细胞模型

从本院中心实验室获得的CRC细胞系SW480，在含有10% FBS（Gibco公司，美国）的DMEM（Hyclone公司，美国）中培养。将细胞在37 ℃，5% CO2的培养箱中培养。丙泊酚干预细胞，在麻醉维持期间，丙泊酚的浓度范围为5至50 μM［10］。在该研究中，丙泊酚分别以浓度梯度（1，5，10，20 μg/mL）施用于细胞4 h。从SW480细胞中分离总RNA，并通过逆转录PCR试剂盒（Takara，Japan） 合 成cDNA。 从cDNA扩 增BNIPL-2 mRNA的CDS序列并插入Fugw载体。通过使用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher公司，美国）将载体转染到细胞中。

（二）CCK-8检测细胞增殖

将处于对数生长期的SW480结直肠癌细胞用胰酶消化后，以5×103个/孔细胞接种于96孔培养板中，待细胞贴壁后分别加入DMSO和不同浓度的丙泊酚（浓度分别为1，5，10，20 μg/mL），37 ℃，5% CO2的培养箱中培养4 h后，每孔加入100 μL培养基和10 μL CCK-8检测试剂，继续孵育2 h后，用酶标仪测定450 nm处OD值。设3个复孔。

（三）qRT-PCR

使用RNAiso Plus（TaKaRa公司，日本）根据说明书从CRC细胞中分离总RNA。使用M-MLV逆转录酶（Invitrogen公司，美国）将总共1 μg RNA转化为cDNA。使用SYBR Green（Enzynomics公司，韩国）分析相对基因表达。进行实时PCR并使用CFX分析数据（Bio-Rad公司，美国）。

三、统计学分析

采用SPSS 16.0软件进行统计学处理。组间的比较用方差分析，组与组之间的比较用LSD-t检验。P＜0.05被认为差异具有统计学意义。

结 果

一、BNIPL-2在结肠癌组织中上调并且与预后不良相关

为了检测BNIPL-2表达是否与结肠癌相关，我们分析了43个正常组织样本和来自TCGA的459个肿瘤样本中BNIPL-2的表达水平，发现与正常组织相比结肠癌样本中BNIPL-2水平显著上调（图1A）。Kaplan-Meier生存曲线用于分析不同水平的BNIPL-2表达是否与结肠癌患者的预后相关。我们将患者分为两组，BNIPL-2低表达和高表达组，发现与高表达结肠癌患者相比，BNIPL-2表达较低的患者拥有较高的存活率。此外，BNIPL-2低表达患者的5年生存率与BNIPL-2高表达患者相比生存率显著提高（图1B）。

图1 TCGA分析。1A：与正常组织相比，肿瘤样本中的BNIPL-2表达水平较高；1B：BNIPL-2高表达组的生存率低于低表达组

二、BNIPL-2的高表达与CRC的恶性阶段相关

因为BNIPL-2高表达与预后不良的关系，我们假设BNIPL-2表达与恶性特征相关。我们发现在Ⅳ期患者的BNIPL-2水平表达较高，而在Ⅱ期和Ⅲ期BNIPL-2的表达水平较低（图2A）。我们进一步分析了TNM分期，发现与低表达组相比，BNIPL-2表达较高的患者在M1期更多（图2B）。BNIPL-2的表达与N分期分类之间没有显著差异（图2C）。然而，T分期分析显示，与低表达结肠癌组织相比，BNIPL-2高表达的癌组织常处于T4期（图2D）。

三、BNIPL-2促进CRC细胞系SW480的增殖

我们通过基因集富集分析（GSEA）检测了与CRC转录组谱中BNIPL-2表达相关的肿瘤发生和发育相关调控途径，发现BNIPL-2高表达组织中细胞迁移相关信号通路被激活。SW480细胞中BNIPL-2的异位表达上调细胞周期蛋白D，细胞周期蛋白E的表达，下调细胞周期抑制因子P21的表达（图3）。

四、丙泊酚对SW480结肠癌细胞增殖作用的影响

CCK-8结果显示，经过浓度分别为1 μg/mL，5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL丙泊酚处理4 h后，结肠癌SW480细胞增殖受到明显抑制，呈浓度依赖性，各浓度组与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01，见图4）。提示丙泊酚能抑制SW480细胞增殖。

五、通过不同浓度的丙泊酚调节BNIPL-2基因的表达

为了阐明丙泊酚抑制CRC细胞增殖的机制，通过qRT-PCR分析SW480细胞中BNIPL-2基因的表达（P＜0.05，见图5）。BNIPL-2随丙泊酚的浓度升高而降低。提示丙泊酚能下调BNIPL-2的表达水平。

图2 BNIPL-2在结肠癌组织中的表达情况。2A：在IV期BNIPL-2表达水平增高，而在II期和III期BNIPL-2表达水平较低；2B：与低表达BNIPL-2的癌组织相比，BNIPL-2高表达的癌组织在M1更多；2C：BNIPL-2的表达与N分期分类之间没有显著差异；2D：与低表达结肠癌组织相比，BNIPL-2高表达的癌组织常处于T4期

图3 qRT-PCR检测细胞周期蛋白。qPCR显示SW480细胞中BNIPL-2上调细胞周期蛋白D1，细胞周期蛋白E1的表达，下调细胞周期抑制因子P21的表达

讨 论

丙泊酚作为最广泛使用的静脉麻醉药之一，在临床麻醉中被广泛应用于成年人、儿童、老人等手术中并发挥了多重优势［10-11］。除了麻醉效果外，异丙酚还具有多种非麻醉作用，如神经保护［12］，抗氧化［13］，抗焦虑［14］和抗肿瘤［15-16］等。

在本研究中，我们使用了从TCGA获得的459名肿瘤患者和43名对照患者，并将它们分为低BNIPL-2和高NIPL-2表达组。Kaplan-Meier曲线分析表明，BNIPL-2高表达与结肠患者的生存率呈负相关。在结肠癌组织中BNIPL-2上调并且与预后不良相关。

之后，本研究提供了证据表明丙泊酚对结肠癌细胞增殖的抑制作用，肿瘤细胞的细胞增殖能力与丙泊酚浓度呈负相关。随着丙泊酚的浓度升高，肿瘤细胞的增殖能力显著下降。同时丙泊酚可以调节BNIPL-2的水平降低，q-PCR分析表明丙泊酚呈浓度依赖性抑制BNIPL-2的表达水平。我们在体外细胞模型中证实了这些结果。以前的研究表明丙泊酚可以减少许多癌症的转移和进展，包括结肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌和宫颈癌［17-21］。然而，丙泊酚在癌细胞中是否通过BNIPL-2的作用仍然知之甚少。在这项研究中，我们证明了这一点。我们的数据还证实丙泊酚以剂量依赖性方式降低SW480结肠癌细胞的增殖活性。

综上，本研究进一步探讨了丙泊酚通过下调BNIPL-2的表达对结肠癌患者的生存率的改善，并且能够抑制肿瘤细胞的增殖作用。故认为BNIPL-2参与并调控结肠癌细胞的增殖。但目前确切的作用机制与信号通路等问题仍将进一步研究。

图4 CCK-8检测不同浓度丙泊酚对细胞增殖的影响；表明经过浓度分别为1，5，10，20 μg/mL丙泊酚处理，SW480细胞增殖受到明显抑制，呈浓度依赖性

图5 qRT-PCR分析SW480细胞中BNIPL-2基因的表达。表明BNIPL-2 表达水平随丙泊酚的浓度呈依赖性下降