补脾清肺方对耐药铜绿假单胞菌毒力因子的影响

樊长征 周伟 张勇鹏

[摘要] 目的 探討补脾清肺方治疗下呼吸道耐药铜绿假单胞菌（PA）感染的作用机制，为治疗PA所致下呼吸道感染提供依据。 方法 SPF级雄性SD大鼠，体重240～260 g，2～3月龄，共30只，设空白对照组（n = 10），不造模，给予等体积生理盐水灌服；模型组（n = 10），造模后，给予等体积生理盐水灌服；中药组（n = 10），造模后，给予2倍剂量（10.68 g）中药灌服，以PA液注入大鼠气管内的方法建立大鼠下呼吸道感染模型，以补脾清肺方进行干预。测定弹性蛋白酶及绿脓菌素含量。 结果 在弹性蛋白酶含量上，中药组与模型组比较，中药组弹性蛋白酶含量降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；中药组与空白对照组比较，中药组弹性蛋白酶含量升高，差异无统计学意义（P > 0.05）；模型组与空白对照组比较，模型组弹性蛋白酶含量升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。在绿脓菌素含量上，中药组与模型组比较，中药组绿脓菌素含量升高，差异无统计学意义（P > 0.05）；中药组与空白对照组比较，中药组绿脓菌素含量升高，差异无统计学意义（P > 0.05）；模型组与空白对照组比较，模型组绿脓菌素含量升高，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 补脾清肺方可以显著减轻气道炎性反应，降低弹性蛋白酶的含量，减轻PA侵袭。

[关键词] 补脾清肺中药；中医药治疗；耐药铜绿假单胞菌；下呼吸道感染；毒力因子

[中图分类号] R28；R73 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）05（a）-0020-05

Effect of Bupi Qingfei Decoction on virulence factors of drug-resistant Pseudomonas aeruginosa

FAN Changzheng1 ZHOU Wei2 ZHANG Yongpeng3 TANG Xudong4 FAN Maorong1 MIAO Qing1 ZHANG Qiong1 YUAN Shasha1

1.Department of Respiration， Xiyuan Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China； 2.Department of Respiration， Beijing Chinese Medicine Hospital Pinggu Branch， Beijing 101200， China； 3.Department of Internal Medicine， Huanghua Development Zone Bo′ai Hospital， Hebei Province， Cangzhou 061100， China； 4.China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China

[Abstract] Objective To investigate the mechanism of Bupi Qingfei Decoction in the treatment of drug-resistant Pseudomonas aeruginosa （PA） infection of the lower respiratory tract， to provide evidence for the treatment of PA-induced lower respiratory tract infection. Methods A total of 30 SPF male SD rats， weighing 240-260 g， aged 2-3 months. Blank control group （n = 10） was set， no model was made， and equal volume of normal saline was given. In the model group （n = 10）， normal saline of equal volume was administered after modeling. The rats in the traditional Chinese medicine group （n = 10） were given 2 times the dose （10.68 g） of traditional Chinese medicine after modeling， and the rats′ lower respiratory tract infection model were established by injecting PA solution into rats′ trachea， given Bupi Qingfei Decocion for intervention. The contents of elastase and pyocyanine were determined. Results In terms of elastase content， compared with the model group， the elastase content in the traditional Chinese medicine group decreased， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. Compared with the blank control group， elastase content in the traditional Chinese medicine group increased， and the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Compared with the blank control group， the elastase content in the model group increased， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. In terms of the content of pyocyanine， compared with the model group， the content of pyocyanine increased in the traditional Chinese medicine group， and the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Compared with the blank control group， pyocyanine content increased in the TCM group， and the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Compared with the blank control group， the content of pyocyanine in the model group increased， and the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Conclusion Bupi Qingfei Decoction can significantly improve airway inflammation， reduce the content of elastase and relieve the PA′s invasion.

[Key words] Bupi Qingfei Decoction； TCM treatment； Drug-resistant Pseudomonas aeruginosa； Lower respiratory tract infection； Virulence factor

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是院内下呼吸道感染最常见病原体之一；也是支气管扩张症等结构性肺病的定植菌，并诱发反复感染。现有抗生素治疗对耐药PA下呼吸道感染作用有限，从而导致肺衰竭最终导致患者死亡。PA是一种机会主义病原体，它利用群体密度感应（quorum-sensing，QS）系统来协调多种毒力因子的表达[1]，毒力因子可以帮助病原体侵入并抵抗宿主的防御机制，增强致病能力。PA产生的毒力因子包括弹性蛋白酶、绿脓菌素和外毒素A等。研究表明，毒力因子产生的毒害与QS系统关系十分密切[2-3]。PA的耐药机制复杂，是医院获得性感染重要的病原菌，其中弹性蛋白酶、绿脓菌素等毒力因子的表达是PA耐药的重要原因之一，同时PA致病能力的强弱由毒力因子的表达与变化决定。研究表明，PA的QS系统可以调控多种毒力因子表达，如弹性蛋白酶、绿脓菌素等[4]。同时通过对QS的研究发现，PA的毒力因子表达、生物被膜等众多致病因子被QS系统控制，特别是弹性蛋白酶的产生受QS系统高度控制，特异性抑制QS系统，能够在不影响细菌生存的情况下抑制细菌的多种毒力因子表达[5-6]。而从丰富的中医药治疗下呼吸道感染临床经验中寻找有效方药并研究其对PA毒力因子的影响及机制有可能为中医药治疗下呼吸道耐药PA感染提供新思路及新方法。据此，本研究采用PA菌液注入大鼠气管内的方法建立大鼠下呼吸道感染模型，并以此为研究对象，给予补脾清肺方干预治疗，观察下呼吸道PA感染模型大鼠气管肺组织病理学及检测PA的主要毒力因子（弹性蛋白酶、绿脓菌素等）的分泌改变，探索补脾清肺方治疗下呼吸道PA感染的初步机制，为下呼吸道耐药PA感染中医药防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 SPF级健康成年雄性SD大鼠，购于斯贝福（北京）实验动物科技有限公司，体重240～260 g，2～3月龄，许可证号：SCXX（京）2011-0004。饲养于中国中医科学院西苑医院动物实验中心，空调下架式笼养，环境温度（23±3）℃，湿度（55±5）%，每天自由饮水（清洁自来水）及进食标准饲料。

1.1.2 菌株 PA购于中国药物检验所，菌株复苏鉴定后培养，监测OD值为600，收获6×108 CFU/mL新鲜菌供后续实验。

1.1.3 主要仪器 图像分析软件（LOGENE-I医用图像处理系统）；病理切片机（德国，LEICA RM2235）；37℃恒温箱；标准规格酶标仪。普通光学显微镜（日本，OLYMPUS BX41）

1.1.4 主要试剂 大鼠弹性蛋白酶ELISA试剂盒（批号：JK-ELISA-13082）；氯仿（国药集团化学试剂有限公司，批号：20170215）。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制作 以PA菌液注入大鼠气管内的方法建立下呼吸道PA感染大鼠模型，造模型大鼠20只，同时设空白对照组大鼠10只，共30只。动物均在无菌环境中饲养。记录模型的成功率、稳定性及均衡性。

下呼吸道PA感染大鼠模型：除空白对照组外，其余各组大鼠参照本课题组最新建立的下呼吸道PA感染大鼠模型制备方法：大鼠腹腔注射戊巴必妥钠麻醉后仰卧位固定，选择唇下3 cm处常规消毒作纵向1 cm切口，暴露颌下肌群，縱向分离出气管。选择甲状软骨下较宽的气管软骨间隙以微量进样器插入气管中快速注入0.02 mL（108 CFU/L）PA菌液和l mL气体，迅速拔出微量进样器并竖起固定板，保持大鼠垂直体位，以缓解呼吸障碍。待大鼠呼吸平稳后横向缝合颈部肌群及皮肤。腹腔注射青霉素3 d，预防伤口感染。每天以50%葡萄糖液100 mL/kg灌胃3 d。14 d后评价模型是否成功。模型成功标准[7]：病理学可见扩张支气管被覆上皮细胞增生、脱落；以脓细胞、单核细胞、淋巴细胞为主的大量炎症细胞浸润；黏膜下层萎缩，平滑肌萎缩、断裂被纤维组织代替；浸润处形成支气管炎、支气管周围炎、肺炎等斑片状病灶。

1.2.2 分组设计 设空白对照组10只，不造模，给予等体积生理盐水灌服；模型组10只，造模后，给予等体积生理盐水灌服；中药组10只，造模后，给予2倍剂量（10.68 g）中药灌服。对造模过程中由于操作失误而致死亡者给予补充。

1.2.3 给药方案 补脾清肺方组成：党参20 g、炙黄芪30 g、柴胡10 g、前胡10 g、乌梅10 g、黄连6 g、鱼腥草30 g、黄芩15 g、法半夏10 g、茯苓15 g、桔梗12 g、炙甘草10 g。给药量根据人与大鼠体表面积换算方法计算，按人体每日用药量的2倍剂量给药。采用配方颗粒进行中药质量控制。成人每日生药量（平均体重50 kg）3.56 g/kg，大鼠每日生药量（平均体重250 g）21.36 g/kg，1倍剂量=5.34 g。模型成功后，第2天开始灌胃给药，饲料正常。连续用药14 d。

1.2.4 大鼠气管肺泡灌洗液的采集 最后一次用药后24 h，各组大鼠腹腔注射戊巴必妥钠麻醉后仰卧位固定，选择唇下3 cm处常规消毒作纵向1 cm切口，暴露颌下肌群，纵向分离出气管，暴露气管，结扎甲状软骨端。自甲状软骨向气管内注射生理盐水5 mL，反复冲洗3次，每只大鼠尽可能抽回冲洗液5 mL作为铜绿假单胞菌培养物，然后进行过滤分装冷藏保存备用。

1.2.5 弹性蛋白酶含量测定 按大鼠弹性蛋白酶的ELISA试剂盒说明进行操作。准备试剂，气管肺泡灌洗液样品和标准品，加入准备好的样品和标准品，37℃反应90 min，洗板2次，加入生物素化人血管生成素（ANG）抗体工作液，37℃反应60 min，洗板3次，加入ABC工作液，37℃反应30 min，洗板5次，加入TMB显色液，37℃反应，加入TMB终止液，30 min内读OD值，计算标本弹性蛋白酶含量。

1.2.6 绿脓菌素测定 采用氯仿萃取法，步骤如下：取1 mL气管肺泡灌洗液做PA培养物，取菌液3 mL测定其OD值600后加入3 mL氯仿萃取，然后在萃取到1 mL的0.2 N的HCl中，得到一个澄清透明的液体，测定其在520 nm处OD值，即为菌液绿脓菌素的相对浓度。相同条件重复实验3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 弹性蛋白酶含量测定

中药组与模型组比较，中药组弹性蛋白酶含量降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；中药组与空白对照组比较，中药组弹性蛋白酶含量升高，差异无统计学意义（P > 0.05）；模型组与空白对照组比较，模型组弹性蛋白酶含量升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。空白对照组弹性蛋白酶含量最低，模型组弹性蛋白酶含量最高。见表1。

2.2 绿脓菌素含量测定

中药组与模型组比较，中药组绿脓菌素含量升高，差异无统计学意义（P > 0.05）；中药组与空白对照组比较，中药组绿脓菌素含量升高，差异无统计学意义（P > 0.05）；模型组与空白对照组比较，模型组绿脓菌素含量升高，差异无统计学意義（P > 0.05）。中药组绿脓菌素最高，空白组绿脓菌素最低。见表2。

3 讨论

目前直接杀死细菌和减弱其毒力是控制PA感染的主要策略。直接杀死细菌策略被广泛应用，抗菌药物的广泛应用，产生细菌多重耐药、菌群失调等多方面的负面作用。研究者们开始研究减弱细菌毒力的策略，选择阻止细菌的毒力使其无法对抗宿主免疫防御，进而被机体清除[8]。国内外以干扰群体感应系统作为抗菌靶位的新药物研究试验较多。PA的毒力因子表达、生物被膜等众多致病因子被QS系统控制，特别是弹性蛋白酶的产生受QS系统高度控制，特异性抑制QS系统，能够在不影响细菌生存的情况下抑制细菌的多种毒力因子表达[9-10]。一是海洋蓝藻细菌提取物，通过干扰LasR活性影响PA毒力。二是抗生素类，如环丙沙星、阿奇霉素、头孢他啶等在其亚抑菌浓度下能够通过干扰细菌群体感应系统影响PA毒力。三是浓度为5%的人参浸出液，能抑制群体感应系统，降低蛋白酶活性影响PA毒力。还有学者[11]利用群体感应系统抑制物选择器筛选出一些影响群体感应系统的非毒性化合物，如纯化学药品、食物分离物和中草药等。上述研究均取得了不同程度的研究成果，不过这些研究大多为体外研究，未能在临床治疗中得到试验及运用。

中医药治疗耐药细菌感染方面具有独特的作用优势，临床中常用中药联合抗生素治疗耐药性PA感染疾病[11]。笔者发现在古文献，元代沙图穆秀克所著《瑞竹堂经验方·羡补门》柴前连梅散治疗咳嗽日久，咳吐青绿痰病证，效果非常明显，这与下呼吸道耐药PA感染患者反复咳吐青绿痰与之咳嗽日久、咳吐青绿痰病证非常相似。在以上基础上笔者自拟补脾清肺方用来治疗下呼吸道耐药PA感染，取得了一定效果。本研究团队回顾总结了下呼吸道感染90例患者的中医证候进行调查，发现46.7%的患者存在脾虚证，初步证实补脾清肺中药能够改善患者的免疫功能，减轻症状[12]。在此基础上运用补脾清肺中药（补中柴前连梅煎）治疗70例下呼吸道PA感染（支气管扩张症）患者12周，随访12周，试验组的急性加重次数为0.48次/人，对照组为0.53次/人，可明显减少急性加重次数[13]。前期研究[14]表明补脾清肺方可明显改善下呼吸道PA感染模型大鼠血管周围炎性浸润、间质性肺炎及细支气管支气管周围炎性浸润，其作用主要为整体调理作用。本研究从分子生物学方面研究补脾清肺方对下呼吸道PA感染毒力因子的影响机制。

弹性蛋白酶的毒性作用主要有：①降解人体非胶原蛋、白细胞胶原等，使肺基底膜完整性受损，致肺气道物理屏障破坏；②干扰人体免疫应答，降解免疫球蛋白IgG和IgA；③干扰纤维细胞生长，水解生物被膜内部运输孔道[15]；④破坏肺部结构，降解肺弹性蛋白，影响肺部的收缩和舒张，引起肺损伤[16]。绿脓菌素毒性作用[17]主要有：①抑制呼吸道纤毛的功能，使PA在呼吸道更容易定植；②抑制宿主对病原体的特异性免疫清除；③阻断细胞呼吸链，致细胞死亡。潘婷婷等[18]发现PA的QS基因表达量越高，弹性蛋白酶的活力越强，毒力作用越强，致病力越强。绿脓菌素分泌量与PA的LasI基因表达量成正相关，因此，QS可通过增强PA的弹性蛋白酶活力，使PA进一步侵袭宿主，加重患者病情。有两项研究[19-20]也证实了LasR和RhlR基因参与了绿脓菌素分泌。本研究发现补脾清肺方可以降低支气管扩张并PA感染大鼠气管肺泡灌洗液中弹性蛋白酶的含量，而对绿脓素的含量无明显影响，说明补脾清肺方可以降低PA毒力因子弹性蛋白酶的表达，进而改善PA感染，但补脾清肺方如何影响PA群体感应系统进而降低弹性蛋白酶的表达需要进一步研究。补脾清肺方对绿脓素的表达无影响，需要进一步研究补中柴前连梅煎对PA的LasI基因表达的影响，是否因基因表达无增加而导致绿脓素含量无增加。

4 小结

本研究通过补脾清肺方干预下呼吸道PA感染大鼠模型的反应性效应及PA毒力因子（弹性蛋白酶含量及绿脓菌素）变化，探讨了补脾清肺方治疗下呼吸道PA感染的作用机制，结果提示补脾清肺方可以显著减轻气道炎症，降低弹性蛋白酶的含量，减轻PA侵袭。仍需进一步研究补脾清肺方对PA群体感应系统的影响机制。

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（收稿日期：2018-10-24 本文编辑：金 虹）