理冲汤对异种移植子宫肌瘤小鼠免疫逃逸相关因子的影响

刘宇 李冬华 王文娜

[摘要] 目的 從免疫逃逸角度探讨“扶正祛瘀”中药理冲汤对异种移植子宫肌瘤小鼠吲哚胺-2，3双加氧酶（IDO）和叉头状螺旋转录因子3（Foxp3）表达的影响。 方法 采用完全随机分组法将32只CB-17 Scid雌性小鼠分为正常组、模型组、理冲汤组和阳性药组，每组8只。采用异种移植法制备子宫肌瘤动物模型；造模成功后，理冲汤组给予理冲汤，阳性药组给予米非司酮，正常组和模型组给予等量生理盐水，连续干预4周后进行组织样本采集。通过HE染色观察各组小鼠子宫平滑肌组织病理学改变；采用免疫印迹法检测各组小鼠子宫平滑肌组织中IDO表达含量；采用实时荧光定量PCR检测Foxp3 mRNA的表达含量。 结果 与模型组比较，理冲汤组小鼠子宫内膜及肌层增厚现象减轻，纤维组织含量较少；理冲汤组小鼠子宫平滑肌组织中IDO、Foxp3 mRNA表达含量较模型组明显降低（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 理冲汤具有抑制子宫肌瘤发生发展的作用，其药理机制可能与阻断肿瘤免疫逃逸途径相关。

[关键词] 理冲汤；子宫肌瘤；免疫逃逸；吲哚胺-2，3双加氧酶；叉头状螺旋转录因子3

[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）05（a）-0012-04

Effect of Lichong Decoction on the expression of immune escape factors in the mice with heterograft uterine fibroids

LIU Yu LI Donghua WANG Wenna WEI Chao QIU Tiantian

College of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China

[Abstract] Objective To explore the effects of Lichong Decoction on the expression of indoleamine 2，3-dioxygenase （IDO） and forkhead winged helix transcription factor-3 （Foxp3） in xenograft mice with human uterine fibroids from the perspective of immune escape mechanism. Methods Thirty-two female mice of CB-17 scid were divided into normal group， model group， Lichong Decoction group and positive drug group according to completely randomized method， with 8 mice in each group. The animal model of uterine leiomyoma was established by xenotransplantation. After successful modeling， Lichong Decoction group was given Lichong Decoction， positive drug group was given Mifepristone， normal group and model group were given the same amount of saline， and tissue samples were collected after 4 weeks of continuous intervention. The histopathological changes of the uterine smooth muscle of mice in each group were observed by HE staining， and the expression of IDO in the smooth muscle tissue of mice in each group was detected by Western blot， and the expression of Foxp3 mRNA was detected by Real-time PCR. Results Compared with model group，the thickness of endometrium and muscle layer of mice in Lichong Decoction group was reduced， and the content of fibrous tissue was less compared with the model group. The expression of IDO and Foxp3 mRNA in uterine smooth muscle tissue of mice was significantly reduced in Lichong Decoction group （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Lichong Decoction has the effect of inhibiting the occurrence and development of uterine fibroids， and its pharmacological mechanism may be related to blocking tumor immune escape.

[Key words] Lichong Decoction； Hysteromyoma； Immune escape； Indoleamine 2，3-dioxygenase； Forkhead winged helix transcription factor-3

子宫肌瘤（uterine leiomyoma）主要由子宫平滑肌细胞增生而成，因组织中含有起到支撑作用的纤维存在，故又称为子宫纤维瘤，临床上以腹部包块、疼痛和出血等为主要症状[1]。子宫肌瘤作为妇科“第一瘤”，其发病率仍呈上升态势，且患者愈发年轻化[2]。目前临床上通常采用激素类调节药物作为治疗子宫肌瘤的常规药物，但因激素的不良反应多而限制了其长期使用。经研究发现，中药理冲汤可以通过诱导肿瘤细胞凋亡、抑制血管生成等方式抑制子宫肌瘤的发生发展[3-4]，但其是否能抑制肿瘤免疫逃逸还有待进一步考证。免疫逃逸是指肿瘤细胞通过多种方式逃避机体免疫系统的识别和攻击，从而得以在体内生存和增殖的过程。子宫肌瘤作为肿瘤的一种，很有可能存在这一过程。因此，本研究以免疫逃逸为出发点，采用异种移植法制备子宫肌瘤小鼠模型，观察中药理冲汤对肌瘤组织形态学的改变，以及对免疫逃逸相关因子吲哚胺-2，3双加氧酶（IDO）和叉头状螺旋转录因子3（Foxp3）表达的影响，旨在为临床用药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 CB-17 Scid小鼠[北京维通利华实验动物科技有限公司，SCXK（京）2016-0001]，雌性，未孕，6～9周龄，共32只，饲养于首都医科大学SPF级动物房，恒温（25～27℃），恒湿（45%～50%），使用独立通气笼盒。

1.1.2 实验药物 理冲汤：生黄芪9 g、党参6 g、白术6 g、生山药15 g、天花粉12 g、知母12 g、三棱9 g、莪术9 g、生鸡内金9 g（北京同仁堂饮片有限责任公司），自制成含生药量为1.7 g/mL的水煎剂；按照参考文献[5]中的方法将米非司酮（北京紫竹药业有限公司，43110 911）用0.5%羧甲基纤维素（Sigma，C5678）配制成浓度为0.7 g/mL的悬液；黄体酮注射液（上海通用公司，130905）；苯甲酸雌二醇注射液（天津金耀氨基酸公司，0703121）；碱性成纤维细胞生长因子（SAB公司，70402）；表皮生长因子（SAB公司，70504）。

1.1.3 仪器与试剂 光学显微镜（日本Olympus公司，TH-200/OLYMPUS V-RFL-T）；离心机（中国长沙湘仪离心机仪器有限公司，TDZ5-WS）；CO2培养箱（美国Sigma公司，HH CP-01W）；WB电泳仪（美国BIO-RAD公司，552BR143016）；实时荧光定量PCR仪（美国Gorbett Research公司，Rotor-Gene 3000）。IDO一抗（美国Abcam公司，Ab106134）；Foxp3一抗（美国Abcam公司，Ab36607）。

1.2 方法

1.2.1 人子宫肌瘤细胞悬液的制备 子宫肌瘤样本来源于首都医科大学附属北京妇产医院因患子宫肌瘤行全子宫切除术者，纳入患者确认在术前3个月均未接受过激素和其他药物治疗，经病理学对子宫肌瘤样本进行证实。无菌操作取手术切除新鲜子宫肌瘤组织约1 cm3，置于10 mL 3%双抗（青链霉素）的PBS中，密闭冰浴迅速送入细胞培养室。将组织剪碎，在缓冲溶液中消化2～3 h后，进行碎片净化，使用70 mm的过滤网收集细胞，在含20% FBS培养液和抗菌溶液的培养基中悬浮培养，收集新鲜子宫肌瘤细胞悬液立即用于小鼠宫内异种移植。

1.2.2 异种移植小鼠子宫肌瘤模型的建立 将32只CB-17 Scid雌性小鼠按完全随机分组法分为正常组、模型组、理冲汤组和阳性药组，每组8只。除正常组外，其他各组小鼠在异种移植之前，均使用雌激素和孕激素皮下释放颗粒至少1周，以促进子宫发育。用甲苯噻嗪/氯胺酮对小鼠进行麻醉，剖腹探查术剥离子宫，在子宫左侧分角处注入含有表皮生长因子（0.5 ng/mL）、碱性成纤维细胞生长因子（2 ng/mL）和胰岛素（5 mg/mL）的基质胶，同时注入抗生素。将伊文思蓝添加至子宫肌瘤细胞悬液中，并注入小鼠子宫右侧分角处，以保证注射部位的可视化，术后进行腹膜伤口缝合。4周后每组随机抽取1只小鼠对子宫组织进行组织病理学检测，若子宫平滑肌層出现明显增厚和纤维化，即确定造模成功。

1.2.3 药物干预 所有药物在灌胃前均加热至30℃。理冲汤组每日灌服理冲汤浓缩液，用药量为30 g/kg。阳性药组每日灌服米非司酮悬液，用药量为2.9 mg/kg。正常组和模型组小鼠每日灌以等量生理盐水。连续灌服4周。

1.2.4 HE染色 对各组小鼠子宫进行肉眼观察，然后取子宫分角以上0.5 cm相同部位一段子宫，10%中性甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下进行组织病理学检查。

1.2.5 免疫印迹法 取250～500 mg经液氮冻存后的子宫肌瘤组织样品，加1 mL含蛋白酶抑制剂的总蛋白裂解液（含蛋白酶抑制剂与磷酸化酶抑制剂），匀浆后抽提总蛋白，Lowry法测蛋白质含量。每例标本取蛋白100 μg，经10%聚丙烯凝胶电泳分离后电转至PVDF膜，封闭后，加一抗（抗磷酸化多克隆抗体），4℃过夜，加二抗，37℃轻摇2 h，DAB显色。显色条带在Quantity One分析软件上测定灰度值，并进行定量分析。每次实验重复4次，检测理冲汤对小鼠子宫平滑肌组织IDO蛋白含量的影响。

1.2.6 实时荧光定量PCR（Real-time PCR）法 取子宫分角以上相同部位一段子宫，每50～100毫克组织样品加入1 mL的Trizol，抽取待测样品的RNA并进行质量检测，使用SuperScript RT试剂盒，将样品RNA逆转录为cDNA并进行扩增。以小鼠β-actin作为内参，由GenBank数据库中获得Foxp3基因序列，设计并合成相应的Real-time PCR引物。采用荧光定量PCR仪Bio-Rad CFX Manager软件分析，查看Foxp3基因的扩增情况，记录相应的Ct值，基因相对表达量采用公式2-ΔΔCt方法计算，并以此判定样本中Foxp3基因mRNA表达量的差异。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件包对所有数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析法（One-way ANOVA），组间进一步两两比较采用LSD-t或Tamhane′s T2法；非正态分布的计量资料比较采用非参数统计中的多个独立样本Kruskal-Wallis H检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色病理分析

HE染色光镜下观察，正常组小鼠子宫平滑肌细胞排列整齐，呈流水样，外纵行肌与内环行肌结构清晰，腺体上皮细胞为单层柱状；模型组小鼠子宫平滑肌层明显增厚，内环肌和外纵肌排列紊乱，肌束间出现大面积呈编织状排列的纤维结缔组织，肌细胞肥大、短缩，细胞核密集，腺体上皮细胞数目增多，密度增加，呈单层或复层柱状；与模型组比较，理冲汤组小鼠子宫内膜及肌层增厚现象减轻，肌纤维排列较为整齐，部分纵横交错，肌间少有纤维结缔组织出现，肌细胞形态规则，多数为长梭型，内膜腺体形态较为正常，呈单层柱状或假复层。阳性药组小鼠子宫平滑肌较模型组稍有变薄，肌纤维排列趋于整齐，肌细胞形态一致，部分出现肥大、短缩现象，内膜上皮细胞改变不明显。见图1。

2.2 免疫印迹法检测免疫逃逸相关因子IDO表达水平

与正常组比较，模型组小鼠子宫平滑肌组织中IDO的蛋白表达水平明显升高（P < 0.01）；与模型组比较，理冲汤组和阳性药组小鼠子宫平滑肌组织中IDO蛋白表达水平明显降低（P < 0.05）。见图2、表1。

2.3 实时荧光定量PCR检测Foxp3 mRNA的表达含量

与正常组比较，模型组小鼠子宫平滑肌组织中Foxp3 mRNA表达量明显升高（P < 0.01）；与模型组比较，理冲汤组和阳性药组小鼠子宫平滑肌组织中Foxp3 mRNA的表达量明显降低（P < 0.01）。见表2。

3 讨论

中藥理冲汤出自《医学衷中参西录》，此书为清代名医张锡纯所著。方中三棱、莪术破瘀除癥，生黄芪、党参补气护血，四药合用补而不滞，破而不伤，天花粉、知母滋阴退热，白术、生山药、生鸡内金益气健脾。全方用药巧妙，配伍严谨，共奏内补中气、外清虚热、活血化瘀、消癥除瘕之功，诚为治疗“正虚血瘀”型子宫肌瘤之良药。其药效正如张锡纯所言：“十余剂后，虚证自退，三十剂后，瘀血可尽消。”现代研究表明，黄芪中的皂苷及黄酮类成分可以起到提高T淋巴细胞亚群水平、增强机体免疫及抗肿瘤的作用[6-9]。三棱、莪术的有效成分可以降低血管内皮生长因子蛋白表达，具有抑制血管生成及抗血栓等作用[10-13]。

肿瘤细胞发生免疫逃逸需经过3个阶段，即清除、平衡、逃逸[14-15]。最初，肿瘤细胞具有较强的抗原性，易被免疫系统所识别，免疫系统动用各种免疫机制可以清除大部分的肿瘤细胞。之后，未被免疫系统消灭的肿瘤细胞通过改变细胞表型等方式降低其自身抗原性，这种改变称为免疫重塑（immune reconstitution），这时部分肿瘤细胞仍可以被免疫系统识别，但新的肿瘤重塑也会随之出现，这样肿瘤细胞与机体免疫达到一种“动态平衡”状态，肿瘤细胞虽可被发现但也无法被彻底清除。直至免疫抑制因子达到一定含量，肿瘤微环境发生彻底改变，肿瘤细胞即可逃避免疫系统的攻击而得以迅速生长，临床上便可观察到原发肿瘤[16]。

IDO在肿瘤细胞的免疫逃逸过程中发挥着重要作用。IDO是一种人体内固有的免疫调节酶，主要由抗原提呈细胞（APC）表达。IDO可以直接抑制T细胞的免疫活性，或者加速色氨酸耗竭，限制T细胞在增殖活动中完成抗原依赖性激活的环节而间接抑制T细胞活性[17-19]。此外，IDO在肿瘤中的过度表达还会影响CD3+T细胞、CD8+T细胞和CD57+NK细胞对肿瘤的浸润[20]。Foxp3是叉状头转录因子家族中的一员，也是调节性T细胞（Treg）的标志性分子。Foxp3与Treg关系密切，经研究显示，肿瘤患者外周血中的Foxp3和Treg均有不同程度的增高[21]。Treg具有免疫负性调节作用，Foxp3可以诱导CD4+ CD25- T细胞向CD4+ CD25+ Foxp3+T细胞转化从而引起免疫抑制，最终导致肿瘤细胞实现免疫逃逸[22-23]。另外，Foxp3作为核内转录因子可以与靶基因结合，调节下游基因的表达进而完成肿瘤细胞的增殖和转移[24]。

本研究发现，中药理冲汤可以改善子宫平滑肌病理结构，降低IDO、Foxp3的表达水平，抑制子宫肌瘤的发生发展，其机制可能与抑制肌瘤细胞实现免疫逃逸有关。现阶段，对于子宫肌瘤的治疗仍有不尽人意之处，临床上亟待一种安全有效、使用方便的药物出现。本研究为子宫肌瘤的药物研发提供实验依据和研究思路，我们可以从肿瘤免疫逃逸角度出发，以特异性抑制IDO、Foxp3为治疗靶点，重新恢复机体免疫功能，以达到在分子水平治疗子宫肌瘤的目的。

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（收稿日期：2018-10-12 本文編辑：张瑜杰）