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基于蛋白质组学和液相色谱-三重四级杆/线性离子阱串联质谱测定鱼糜制品中的大豆过敏原蛋白

2019-06-18

分析仪器 2019年3期
关键词:液质过敏原过敏

(1.衢州检验检疫局综合技术服务中心 , 衢州 324000;2.浙江工商大学 , 杭州 310018 ;3.温州大学 , 温州 325035)

1 引言

鱼糜制品是指以生鲜鱼或者冷冻鱼为原料,加入食盐等辅料经擂溃、斩拌、成型、凝胶化等加工过程形成具有一定弹性的凝胶状食品的总称[1],如鱼肠、鱼糕、模拟蟹肉等海鲜产品[2]。因其高蛋白、低脂肪、营养价值高、味道鲜美等优点而深受消费者的喜爱,进一步提高其经济价值[3]。鱼糜制品在加工时为提高其口感和凝胶强度,通常会加入一定量的蛋白质作为弹性增强剂,主要有大豆蛋白、乳清蛋白、鸡蛋清蛋白等[4]。而这些蛋白恰恰是引起食物过敏常见的食物种类。据统计,全球约8%儿童和约2%成年人对食物过敏,食物过敏已成为威胁人类健康的主要问题之一[5]。避免食用含有过敏原的食物是目前唯一有效的预防办法,为帮助易感人群远离食物过敏,欧盟、美国、澳大利亚、新西兰等国家相继采取食品中过敏原强制标识技术贸易措施[6,7],也对我国鱼糜产品出口造成巨大影响,因标签不符合进口国要求而被通报及退运等往往使中国食品出口企业在过敏原这道壁垒上受挫[8]。

目前,检测食品中大豆过敏原成分主要两种方法:基于抗体的酶联免疫吸附法(ELISA)[9,10]和基于DNA的聚合酶链式反应(PCR)方法[11,12]。但ELISA方法灵敏度不高且存在交叉作用,容易导致假阴性或假阳性结果;PCR技术是基于DNA的检测手段,而不能直接检测致敏蛋白,故限制了它们在食物过敏原中的应用[13]。现阶段,有人尝试将蛋白质组学与液质联用技术相结合的方法对蛋白质进行定性定量分析。Boo[14]等利用LC-MS/MS同时检测饼干中鸡蛋、牛奶、花生中的过敏蛋白,检出限低至5mg/kg。Planque M[15]等人利用液质联用方法定量多种复杂基质中过敏原蛋白,其中大豆过敏原蛋白检出限为5mg/kg。Na Lin[16]等利用同位素标记的多肽作为内标,提高了方法的准确性。液质联用技术因其高灵敏度、特异性能准确的定性定量分析复杂食品基质中的蛋白含量。蛋白的液质检测方法是基于对胰蛋白酶水解产生的肽段进行检测,该肽段具有特异性且能满足定量分析目标蛋白的要求。该方法的关键之处是在于筛选出目标蛋白的一个或者更多的特征肽段。在这个策略基础上,本研究合成了大豆过敏蛋白Glycinin G2的特征肽段来定性定量分析鱼糜制品中大豆蛋白的含量。

目前,对于鱼糜制品中大豆过敏原蛋白的液相色谱-三重四级杆/线性离子阱串联质谱方法未见报道,本研究采用MRM-IDA-EPI采集模式,当多反应监测信号超过设定的阈值时,仪器会被触发交替进行多反应监测和增强子离子扫描,在一次进样过程中既可以采集到多反应监测谱图,也可以采集到增强子离子二级谱图,通过谱库检索达到同时定性和定量的目的。

2 材料与方法

2.1 试剂

二硫苏糖醇(DTT)、碳酸氢铵(NH4HCO3)、碘乙酰胺(IAA)(分析纯)购自美国Sigma-Aldrich 公司;甲酸(FA)(HPLC级)购自美国Tedia 公司;乙腈(ACN)(HPLC级)购自德国Merck 公司;胰蛋白酶(测序级,比活度>8000 units/mg protein)购自美国Sigma-Aldrich 公司。Tris-HCL购置Bio-Rad公司。

鳙鱼购自杭州农贸市场;大豆分离蛋白粉来购自Bio-Rad;安井牌鱼丸、安井牌鱼豆腐、丸之尊鱼豆腐、安井牌仿蟹柳、海霸王牌鱼丸、海霸王鱼豆腐、海霸王牌蟹柳均购置于杭州永辉超市。

特异肽段标准品EAFGVNMQIV购自上海强耀生物科技有限公司,纯度均大于95%;超纯水由Milli-Q超纯水净化系统制备,其他试剂均为分析纯级别。

2.2 仪器设备(表1)

表1 主要仪器信息

2.3 液相条件与质谱条件

2.3.1液相条件

色谱柱:Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱温: 40 ℃;流速:0.3 mL/min;进样量:10 μL;流动相:0.15%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱程序见表2。

表2 流动相梯度洗脱色谱分离条件

2.3.2质谱条件

离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测(MRM);电喷雾电压:5500 V;雾化气压力:30 Pa;气帘气压力:55 Pa;辅助气压力:55 Pa;离子源温度:550 ℃;去簇电压:95 V。大豆过敏蛋白特异肽段标准品质谱参数表3;EPI参数:当MRM响应值大于100 CPS时同时启动线性离子阱的增强子离子扫描功能;增强子离子扫描范围:200~1000 Da;扫描速度10000 Da/s;动态填充时间15 ms。

表3 多反应离子监测参数

注:带*为定量离子。

2.4 标准储备液的配制

分别精密称取2.5 mg大豆过敏蛋白特征肽段EAFGVNMQIVR 于5mL容量瓶中,用20%乙腈~80% 0.15%甲酸水溶解定容,配制成500 μg/mL的特征肽段标准品储备液。置于-20 ℃冰箱保存,保质期为6个月。

2.5 样品预处理

2.5.1蛋白提取

将买来的鱼清洗除内脏,剔除鱼皮和鱼骨,绞碎,分装于-20℃冷藏。称取2 g处理好的鱼肉,加入5 mL 0.2M Tris-HCL,于60℃振荡2 h,振幅200,冷却至室温。8000 rpm/min 10min,取上清液待用。

2.5.2酶解

取500μL上清液,加10μL 500mmol/L DTT,56 ℃水浴加热30min。然后加入30μL 500mmol/L IAA,室温下避光静置30min之后,加入胰蛋白酶(1∶50,w/w,酶与底物浓度比),在37 ℃水浴中酶切16h。加入5μL 甲酸终止反应,于10000rpm/min 离心10min。上清液过0.22μm滤膜,上机测定。

2.6 计算公式

2.6.1基质效应的评价

将处理好的鱼肉作为空白基质,精密移取一定量的特征肽段EAFGVNMQIVR储备液,分别用初始流动相和空白基质酶解液稀释配制成1、5、10、20、50 ng/mL标准曲线溶液,基质效应计算公式如下:

式中:slopematrix为空白基质曲线的斜率;

slopestandard为标准曲线的斜率。

2.6.2 鱼糜制品中过敏蛋白含量的计算公式

式中:X—鱼糜样品中大豆过敏原蛋白的含量,μg/g;

m—鱼糜样品质量,g;

δ—样品的稀释倍数;

c—样品中特异肽段的含量,ng/mL;

V—样品酶解的体积, mL;

M1/M2—大豆过敏蛋白与特征肽段的相对分子质量比值

2.6.3加标回收率

回收率实验是空白鱼糜酶解液中加入低、中、高3个水平的特征肽段,经过LC-MS/MS检测,计算得出结果。回收率的计算公式如下:

回收率%=(C-A)/B×100%

式中:A为供试品中被测组分含量,ng/mL;

B为加入的特异肽段的含量,ng/mL;

C为实际样品中组分值,ng/mL。

3 结果与讨论

3.1 特异肽段的筛选

大豆球蛋白(Glycinin)是大豆抗原蛋白中免疫原性最强的因子之一,约占大豆籽实蛋白总量的40%[17]。Glycinin G2 由485个氨基酸组成,分子质量为54391 Da,主要引发免疫蛋白Ig E介导的Ⅰ型过敏反应[18],且耐热,是大豆过敏蛋白的研究热点。

建立准确定量分析蛋白质的液质联用分析方法,特征肽段的选择至关重要。本方法在查阅相关文献的基础上[14,19-25],筛选出2条大豆的特征肽段后进行实际样品的验证(见表4)。通过液质联用技术得到2条肽段的母离子质荷比信息(图1),从液质图中可以看出,2条大豆过敏蛋白肽段响应值高,灵敏度好。

表4 大豆过敏蛋白选择肽段初筛

图1 2条大豆过敏蛋白肽段的色谱图(5%大豆添加)

同时,考虑到b/y离子类型的肽段比a/x型相对更稳定,因此在满足实验灵敏度和经济成本的前提下选择EAFGVNMQIVR(氨基酸序列位置228-238,相对分子质量1263.49)肽段作为大豆特征肽段,相应的特征肽段标准品二级质谱图见图2。

3.2 质谱参数及谱库的建立

3.2.1质谱参数优化

本研究采用针泵注射大豆蛋白过敏原多肽,在正离子模式下进行一级母离子扫描,得到准分子离子峰[M+2H]+,然后进行子离子扫描得到二级碎片,根据获得的碎片信息建立多反应监测离子对,在多反应监测模式下优化化合物去簇电压、碰撞能量,优化后参数见表3。同时对线性离子阱参数进行优化及设置,参数为当MRM响应值大于100 CPS时同时启动线性离子阱的EPI扫描功能;EPI扫描范围:200~1000 Da;扫描速度10000 Da/s;动态填充时间15 ms。

图2 特征肽段的二级质谱图

3.2.2谱库建立

本研究采用MRM-IDA-EPI扫描谱库检索模式。首先从MRM模式获得化合物的保留时间、峰面积等信息,在利用EPI扫描获得的二级质谱图进行谱库检索。将标准溶液采集到的EPI谱图通过Access编写导入液质数据库,作为标准谱库。对实际阳性可疑样品进行检测,用采集到EPI谱图进行谱库检索。根据purity值进行排序,purity越接近100%,检测到的阳性可疑样品为目标化合物的可能性越大。

3.3 方法学验证

3.3.1基质效应

液质联用技术是对质荷比进行检测,因此目标化合物的离子化程度是检测灵敏度的关键。与纯溶剂相比,基质的存在能不同程度的影响化合物的电离,抑制或增强其电离的响应信号值。因此实验测定了空白基质的基质效应,结果如图3所示。实验将基质效应(ME)范围在0.9~1.1之间的认定为基质效应忽略不计,ME小于0.9的为基质效应抑制作用,ME大于1.1的为基质效应增强作用。结果表明,ME=73.5%(见图3),对特异肽段有明显的抑制作用,表明空白基质的存在对特异肽段的检测存在一定程度的干扰,因此后续实验采用基质加标曲线来补偿基质效应,使实验结果更接近真实情况。

图3 溶剂与空白基质的标准曲线

3.3.2方法的线性关系、LOQ和LOD

分别精密移取特征肽段储备液,用空白鱼糜酶解液稀释成0.5、1、5、10、20、50、100、200 ng/mL的标准溶液,以特征肽段的浓度为横坐标(X),色谱峰面积为纵坐标(Y)做线性回归方程,该方法的线性方程为:Y=14895X-38916,R2=0.9975。

常用信噪比法确定检出限与定量限,以空白鱼糜酶解液作为基质,添加特征肽段储备液,以该肽段的信噪比为3相应的浓度确定检出限,而以信噪比为10相应的浓度确定定量限。结果显示,该方法中鱼糜制品中大豆过敏原蛋白的定量限为0.108 μg/g。

3.3.3加标回收率、精密度

空白鱼糜酶解液中添加低中高(1、5、50 ng/mL)3个浓度特征肽段标准品,得到的峰面积通过工作曲线计算其回收率。结果如表5所示,加标回收率在78.2~108.3% ,相对标准偏差不大于5.9%。

表5 空白鱼糜样品加标回收率和精密度

3.4 实际应用

采用模拟加样的方式,大豆分离蛋白的添加水平设置为1%、2%、5%,同时,采用市售的7个鱼糜制品作为实际样品进行检测,采用基质加标曲线计算含量值,结果见表6。

从检测的实际样品结果可知,其中丸之尊鱼豆腐的配料列表中不含有大豆分离蛋白,但仍检测出大豆过敏原, 其含量在0.87 μg/g。对阳性样品进行EPI扫描谱库检索确认为大豆过敏蛋白多肽。图4为实际样品的EPI谱图谱库检索结果。

表6 实际样品中大豆过敏原蛋白含量

图4 实际样品增强子离子扫描谱图谱库检索结果

4 结论

本实验建立液相色谱-三重四级杆/线性离子阱串联质谱法快速灵敏的检测鱼糜制品中痕量大豆过敏原蛋白的分析方法。通过蛋白组学bottom-up方法成功筛选出大豆过敏蛋白的特征肽段,并采用MRM-IDA-EPI扫描谱库检索方法建立了灵敏度高、特异性强、检出限低的定性定量方法,其定量限达到0.108 μg/g,回收率在78.2~108.3%。对于鱼糜制品中痕量的大豆过敏原蛋白的准确定性定量方法的建立,不仅能为食品标签的规范化提供理论参考,还能避免过敏人群受到伤害,具有很大的现实意义。

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