T-SPOT.TB在肺外结核诊断中的应用价值研究

徐烨

(宜春市人民医院检验科，江西 宜春 336000)

肺外结核是指结核分枝杆菌侵染肺部以外的部位所引起的结核病。肺外结核疾病呈现多脏器、多样性，而且临床症状不典型、不明显，大多数肺外结核来源于肺结核，是由结核分枝杆菌感染肺部后通过血行播散及淋巴循环或逆行传播，或通过结核病灶直接蔓延所致。肺外结核按发病部位、发病脏器命名。肺外结核由于发病隐匿且标本获取困难、病理表现不典型、细菌学阳性率低等原因从而使得肺外结核的早期诊断受到限制。T-SPOT.TB检测是y一干扰素释放试验中的一种，它是以早期分泌靶抗原6和培养滤过蛋白10为抗原，刺激单个核细胞产生y一干扰素，然后用酶联免疫方法检测y一干扰素从而判断是否有结核感染的一种技术[1]。由于其灵敏度特异度较高而成为肺外结核诊断的一项主要技术。

本文通过对我院近1年收治的临床考虑肺外结核患者的T-SPOT.TB、结核抗体、血沉等相关检测资料进行回顾性分析，以评价T-SPOT.TB技术在肺外结核诊断中的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集宜春市人民医院2015年9月至2016年10月收治并确诊为肺外结核患者87例的临床资料，及50例非结核疾病患者和50例健康对照组作为对照。肺外结核纳入标准：⑴标本活检的组织病理结果显示为结核性肉芽肿和干酪样坏死组织。⑵局部脓液涂片或培养提示抗酸杆菌阳性。⑶临床表现、影像学等支持结核、排除其他疾病、且诊断性抗结核有效者。排除标准：肺结核和结核病接触史，使用免疫抑制剂，HIV检测阳性。

1.2 主要仪器和试剂 CO2培养箱（美国Thermo公司）；结核分枝杆菌 T-SPOT（T-SPOT.TB）试剂盒（牛津Immunotec公司）；结核抗体试剂盒（北京健乃喜生物技术有限公司）

1.3 方法 收集患者一般临床资料，对每个研究对象进行T-SPOT.TB、ESR、结核抗体等检测。

1.3.1 T-SPOT.TB检测 采集6ml肝素抗凝血，混匀，4h内进行检测。分离单个核细胞，并制成细胞浓度2.5×106个/ml左右的细胞工作液。取出预包被活化抗体的板条，每份标本分别加4孔，即AIMV（阴性对照）、抗原 A（ESAT-6）、抗原 B（CFP-10）、阳性对照50μl，然后在4孔中均加入100μl配置好的细胞工作液。置CO2培养箱 （37℃，5%CO2，保持湿度）温育16～18h。洗板，加入碱性磷酸酶标记的小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体50μl，4～8℃温育1h。再次用PBS洗板3次，加入显色底物50μl，室温暗处温育8min。取出用蒸馏水冲洗终止反应，晾干，显微镜下进行斑点计数，并记录斑点数量。

1.3.2 结果判断 空白对照孔斑点数为0～5个且（抗原A或抗原B孔的斑点数）－（空白对照孔斑点数）≥6或者空白对照孔斑点数为6～10个且（抗原A或抗原B孔的斑点数）≥2×（空白对照孔斑点数）检测结果为阳性，表明样本中存在针对结核杆菌特异的效应T细胞；如果不符合上述标准且阳性对照孔正常时（斑点数不少于20个）检测结果为阴性。

1.3.3 结核抗体检测 免疫胶体金法。

1.3.4 血沉检测 女性＞20mm/h为阳性，男性＞15mm/h为阳性。

1.4 统计学分析 采用统计软件SPSS 13.0进行数据分析，各组样本率的比较应用Pearson χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床资料 本研究共收集87例肺外结核、50例非结核疾病及50例健康对照者的资料。其中肺外结核患者组中包括男性61例，女性26例，平均年龄（48.43±18.23）岁，包括结核性胸膜炎45例、淋巴结结核10例、骨关节结核13例、结核性腹膜炎8例、结核性脑膜炎6例、结核性心包炎1例、皮下组织结核1例及左乳结核1例；非结核疾病患者组中，男性28例，女性22例，平均年龄（47.35±14.23）岁；健康对照组中，男性 25 例，女性25 例，平均年龄（35.18±16.12）岁。 三组的性别、年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 各组T-SPOT.TB检测阳性率比较 肺外结核组抗原 A（ESAT-6）和抗原 B（CFP-10）检测阳性率分别为83.9%和79.3%，均显著高于健康对照组和非结核疾病组。由于患者对抗原A和抗原B的免疫反应性有所不同，将抗原A和抗原B联合观察结果可显著提高检测的阳性率，见表1。

表1 各组T-SPOT.TB检测阳性率比较

2.3 几种检测项目在肺外结核中的诊断性能比较T-SPOT.TB的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、诊断准确率分别为85.0%、88.0%、92.5%、77.1%、86.8%，均显著高于结核抗体和血沉检测，虽然抗原A、抗原B均有较高的敏感性、特异性及诊断准确率，但是联合抗原A和抗原B检测能显著提高诊断准确率，见表2。

3 讨论

我国是除印度以外的第二大结核高负担国家，估计每年新发130万病例，占全球结核病的14.3%[2]。而有资料显示全球肺外结核约占总结核的 25%-30%，在中国约为 9.7%-11.8%[3，4]。 由于肺外结核存在部位不同，临床表现差异及其复杂性，故肺外结核漏诊、误诊较为常见，诊断较为困难。传统的结核诊断方法有血沉、结核菌涂片、结核菌培养及皮肤结核菌素试验等，其中病原学诊断即结核菌涂片及结核菌培养是结核诊断的 “金标准”。但是肺外结核发病形式不定，多脏器性，临床特征不典型，获得细菌学依据困难，有些需要手术或穿刺活检才能获得标本，故限制了病原学诊断在肺外结核中的应用。而且培养法需要2～8周才能获得结果，耗时过长，结核菌涂片则敏感性太低，通常需要＞5000个菌/ml才能检测到阳性结果[5]。

表2 几种检测项目在肺外结核中的诊断性能比较

结核抗体检测是以纯化的结核分枝杆菌细胞壁蛋白抗原来检测血清中相应的抗体IgG或者IgM。它是已宿主感染结核分枝杆菌后的体液免疫应答为基础，检测血清中结核分枝杆菌抗原特异性的抗体，操作简单、快速、不需要活细胞是它的优点。但是结核抗体的检测敏感度可能与个人的免疫状态有关，机体免疫低下时不能产生抗体则容易造成假阴性，另外如果患者正处窗口期，未产生抗体也容易造成假阴性。又由于抗体交叉反应易造成假阳性结果。崔鲂的研究中显示结核抗体在肺外结核诊断中的灵敏度和特异度分别为59.5%和72.4%，本研究结果与之相近[6]。张晓梅等的研究中TB-Ab对结核的诊断灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为60.6%、76.5%、76.1%、61.1%[7]。

T-SPOT.TB是一种利用结核特异性抗体EAST-6和CFP-10刺激单个核细胞释放y一干扰素，然后再用ELISPOT技术检测释放出的y一干扰素，从而判断结核感染的一种方法。该方法灵敏度高，特异性好，被广泛应用于结核的诊断。本研究中显示在肺外结核诊断中T-SPOT.TB敏感度和特异度为85.0%和88.0%，远远优于结核抗体、血沉等项目。Kim的一项研究中显示对于活动性肺外结核，T-SPOT.TB的敏感性为94%，而PPD的敏感度仅为47%[8]。孙瑛等指出T-SPOT.TB检测对免疫正常的成年人活动性结核诊断敏感性为83%～97%[9]。肺外结核由于其症状不典型，病变部位不确定，故细菌学标本较难获得，而结核T细胞斑点试验使用的是静脉血，不受病变部位影响，因而拓宽了它的应用范围。另一方面，T-SPOT.TB也不受机体免疫力的影响，万荣等对35例HIV合并肺结核患者的研究T-SPOT.TB的敏感度为74.3%，特异度为86.7%，远高于PPD试验[10]。曾江等对87例艾滋病合并菌阴性肺结核患者的一项研究显示TSPOT检测的灵敏度为85.1%[11]。T-SPOT.TB在各种肺外结核的诊断中敏感性均较好，如结核性胸膜炎、肠结核等[12，13]。 T-SPOT.TB 用于诊断结核的标本并不局限于血液标本，结核抗原特异性T细胞具有向病变部位集中的特点，所以也可以用支气管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、脑脊液等等对结核特别是肺外结核进行诊断。刘珍琼等对32例结核性胸膜炎患者的胸腔积液做了T-SPOT.TB检测，检测灵敏度为93.75%，特异度为96.15%，且均高于外周血T-SPOT检测[14]。虽然T-SPOT能够对各种肺外结核进行诊断，如结核性胸膜炎、结核性脑膜炎、肾结核、肠结核等，但是它不能对感染部位进行定位，需要根据其他检查和临床体征做出综合判断，这也是它的局限性所在[15]。

综上所述，T-SPOT.TB能有效的诊断肺外结核，且不受病变部位限制，不受机体免疫力影响，但是由于个人对A、B抗原的反应性不同，需联合检测A、B抗原，这样可以提高诊断准确度。