石菖蒲超临界萃取物对抑郁模型大鼠行为学的影响

王小萌,吴全娥,石 鑫,韩云鹏

(1.黑龙江中医药大学基础医学院，哈尔滨 150036； 2.河北中医学院基础医学院，石家庄 050200； 3.河北中医学院国医堂，石家庄 050200)

抑郁症是常见的精神性障碍疾病，该病发病率高，严重危害患者的身心健康，对其生活学习能力有较大影响，不仅降低患者生活质量，严重时患者甚至会出现自杀现象[1-2]。抑郁症不仅给患者家庭的精神和经济带来巨大的压力和负担，也给社会造成损失和经济负担。目前，抑郁症已成为我国未来需重点防控的疾病之一。石菖蒲是天南星科菖蒲属植物，性味辛、苦、温，归心、胃经，具有开胃化湿、开窍醒脑、益智安神的作用。临床研究表明，石菖蒲可以保护中枢神经系统和抗抑郁的作用[3-4]。但以往石菖蒲在药用时主要以水煎剂的形式使用，这种方法不仅耗时，对草药中有效成分的提取率也降低，而且还会将植物中含有的重金属浓缩到药剂中，在治病的同时又会致病。超临界法降萃取和分离同时进行，对中药中有效成分的萃取能力强，10 min就可以将产品分离，2～4 h可将有效成分完全提取，工艺简单、操作方便，不需蒸发浓缩等工序。超临界萃取得到的产品质量高，天然植物有效成分高度富集并能得到较好的保存，具有巨大的实用价值。本实验在我国传统医学理论的基础上结合现代抗抑郁药物筛选手段，研究石菖蒲超临界萃取物对抑郁模型大鼠行为学的影响，以期为石菖蒲在抗抑郁治疗中的应用提供科学参考。

1 材料与方法

1.1实验材料 实验选用200只健康SD雄性大鼠，体重190～210 g，平均(200±7) g，由黑龙江中医药大学提供(合格证号：SCK黑2015007)，在饲舍内进行适应性饲养，温度为20～24 ℃，平均(22.1±0.8) ℃，每天8:00～20:00为光照时间，自由饮水和饮食。石菖蒲由黑龙江中医药大学提供，经50 ℃烘干、粉碎后过40目筛制成原粉。

1.2实验方法

1.2.1抑郁模型的建立 在预饲养7 d后，采用随机数字法选择大鼠120只，采用慢性不可预知温和应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)法建立抑郁模型，主要包括45°角倾斜鼠笼、持续震荡鼠笼5 min、持续禁食24 h、持续禁水24 h、34 ℃高温饲养24 h、冰水泳5 min、夹尾1 min、0.3 A电流电击足底、昼夜不节律和束缚等应激刺激，造模全程每天随机给予1种应激刺激3次，连续刺激21 d，以糖水偏好度评分显著低于正常大鼠认定为造模成功[5]。在造模期内保持与预饲养期相同的饲养方式，在实验开始第1天给药前对造模大鼠进行糖水偏爱度测试，剔除结果异常的造模大鼠后，选择糖水测试评分接近且显著低于正常大鼠80只进行后续实验，并继续每天给予CUMS法刺激。

1.2.2药液的制备 将石菖蒲原粉装入超临界萃取釜中，于25 MPa、50 ℃下用超临界CO2提取设备提取2.5 h，得到黏稠液态提取物，回收率为4.8%，收集提取液后用超纯水按0.1 g/mL配制成药液。

1.2.3设计和分组 在未造模的正常大鼠中采用随机数字法选取20只作为空白组，80只造模大鼠根据实验处理方法不同分为模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组20只，各给药治疗组分别按药物/体重比为0.05 g/100 g、0.1 g/100 g、0.15 g/100 g给予石菖蒲提取物药液，以灌胃给药治疗第1天为实验第1天，全程共28 d。

1.2.4检测指标和方法

1.2.4.1一般状态评价 在实验第1天开始，每天观察大鼠的体重、进食、自主活动情况、体毛状态和对外界环境变化的反应情况。

1.2.4.2大鼠的糖水偏爱测试 在实验开始第1天和第28天对大鼠进行糖水偏爱度测试。具体方法：在测试开始前训练大鼠适应含有1%蔗糖的饮水，糖水测试实验期间保持饲舍的安静，训练大鼠适应含糖饮水，每笼同时放置2个水瓶，第1个24 h，2瓶均装有1%蔗糖水，随第2个24 h，分别装普通饮用水和含有1%蔗糖的水，位置随机。适应性训练后，将大鼠以每笼1只进行分笼饲养，并禁食禁水24 h，然后在鼠笼随机位置放入1瓶1%的蔗糖水和1瓶普通饮用水，记录1 h瓶内液体的消耗量，排除饮水瓶滴漏所致的液体损耗量。

糖水偏爱度(%)=1%蔗糖水消耗量/(1%蔗糖水消耗量+普通饮用水消耗量)×100%。

1.2.4.3大鼠的强迫游泳实验 在给药第28天强迫大鼠进行游泳测定，每次进行糖水偏爱测试后，在同一安静饲舍内对各组大鼠进行强迫游泳实验，实验开始前对大鼠禁食12 h，实验开始后将大鼠置于水深60 cm，直径约40 cm，水温(25±5) ℃的玻璃容器内，让大鼠强迫游泳10 min，观察第4～7分钟内大鼠漂浮不动的时间，取出大鼠吹干后放回鼠笼，12 h后更换玻璃容器中的水，在原条件下再次重复该实验，合并两组数据后取平均值。

1.2.4.4大鼠的旷场实验 在给药第28天对大鼠旷场行动距离进行观察。将边长为80 cm×80 cm的木板，用黑笔按20 cm×20 cm画成16个小正方格，然后用40 cm高的木板做成围栏，制成大鼠的旷场实验设备，并在围栏上边缘的中央部位安装摄像机，记录大鼠运动情况。实验开始前3 d，每天在实验环境中对大鼠进行抚摸，实验开始后，将大鼠逐只放置于实验装置的中央格子内，实验人员迅速离开，保持室内安静，记录5 min内大鼠的水平运动和垂直运动的得分情况，记录结束后，取出大鼠，打扫实验旷场，并用低浓度乙醇去除大鼠的残留气味。以大鼠至少三只脚跨入同一方格内算一格，大鼠每跨过一个底面方格记1分。以大鼠双上肢离开地面2 cm以上为标准记录大鼠垂直活动得分，每离开一次记1分。

2 结 果

2.1各组大鼠一般状态评价 在实验全程中，空白组体重无显著变化，进食和自主活动情况正常，毛色有光泽，对外界环境变化有一定反应，但不会出现惊恐现象。模型组大鼠随实验时间延长，表现为瘦弱、食欲下降、易倦怠、自主活动减少、体毛枯燥无光泽，并会出现易被外界声音或光线变化惊吓。通过灌胃石菖蒲提取物药液后，各给药组大鼠出现瘦弱和易倦怠情况有所缓解，食欲上升，自主活动增加，体毛逐渐恢复光泽。

2.2各组大鼠糖水偏爱度的比较 实验第1天，模型组和低、中、高、剂量组大鼠糖水偏爱度低于空白组(P<0.05)，但模型组和各给药组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；实验第28天，模型组和低、中、剂量组大鼠糖水偏爱度低于空白组(P<0.05)，低、中、高剂量组高于模型组(P<0.05)，中、高剂量组高于低剂量组(P<0.05)，但中剂量组和高剂量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3各组大鼠游泳不动时间、水平和垂直得分比较 在给药第28天，模型组和低、中剂量组游泳不动时间长于空白组(P<0.05)，低、中、高剂量组少于模型组(P<0.05)，中、高剂量组少于低剂量组(P<0.05)，高剂量组少于中剂量组(P<0.05)；模型组和低剂量组水平得分低于空白组(P<0.05)，低、中、高剂量组高于模型组(P<0.05)，但各给药组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；模型组和低剂量组垂直得分低于空白组(P<0.05)，低、中、高剂量组显著高于模型组(P<0.05)，高剂量组高于低剂量组(P<0.05)，但低剂量组和中剂量组、中剂量组和高剂量组组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

a与空白组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05；c与低剂量组比较，P<0.05

表2 各组大鼠游泳不动时间、水平和垂直得分比较

a与空白组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05；c与低剂量组比较，P<0.05；d与中剂量组比较，P<0.05

3 讨 论

成功的动物模型应具备模拟行为表现的能力和对药效具有较好预测性，疾病模型成功与否会直接影响研究成果的可靠性和科学性。但与其他疾病的模型不同，抑郁症的产生与环境、心理等因素有密切关系，而且动物模型只能够模拟出人类抑郁某些状态[6]。因此，找到一个与人类抑郁状态完全一致的动物模型并不容易。CUMS模型建立方法是运用慢性、低水平的刺激动物产生抑郁状态，这种方法与人类发生抑郁的机制更加接近，而且CUMS模型在模拟快感缺乏的状态方面可持续数个月，基本符合抑郁模型的科研要求[7]。通过CUMS方法建立的抑郁模型能够表现出一系列与人类抑郁患者类似的行为障碍表现，且这些行为障碍可以通过模型动物对糖水偏爱度是否显著降低来评价模型建立成功与否[8]。本实验选用CUMS模型，在全部过程中实随机使用不同类型的刺激方法，使动物无法预测刺激的发生，建立抑郁大鼠模型，并在实验第1天，以糖水偏好度筛选造模成功大鼠。

对奖励反应出现下降的现象属于快感缺乏症状是抑郁症的重要特征之一。目前，多数研究采用糖水偏爱度实验作为衡量抑郁模型动物快感缺乏症状的有效客观指标[9]。研究表明，在建立抑郁模型后，实验动物对糖水的消耗量显著下降，说明实验动物对奖励的反应出现下降[10]。有研究指出，抑郁模型动物对糖水的消耗量下降是因为禁食和禁水后其生理代谢发生变化所致，糖水消耗度的下降综合反映了饥饿、快感缺乏和体重变化的协同作用[11]。本实验通过对大鼠一般状况的观察发现，在造模后大鼠表现出瘦弱，食欲下降，对自主活动的兴趣不大，也证明了糖水的消耗度与大鼠一般状况存在协同作用。还有研究指出，人们在患有抑郁症后，出现的快感缺乏、兴趣缺失和运动迟缓等症状与中枢神经系统内的奖励系统功能受到损伤有关[12]。本实验结果表明，与空白组大鼠相比，模型组的偏爱度显著下降，表现出对1%蔗糖水奖励刺激的低敏感性，这种情况与人类抑郁症的快感缺乏的情况类似。在给予抑郁大鼠灌胃含有石菖蒲超临界萃取物的药液28 d后，在总饮用水物显著差异的情况下，大鼠对糖水的偏爱度显著提高，说明抑郁型大鼠所出现糖水偏爱度下降的情况，已经与禁水导致的饥渴无关，而是与抑郁大鼠对奖励的反应能力出现变化有关。本实验的研究结果也证明，给大鼠按体重比为0.1 g/100 g和0.15 g/100 g的灌胃石菖蒲超临界萃取物可以有效改善抑郁型大鼠出现的快感缺失的情况。

强迫游泳实验是利用动物在不能逃出恶劣环境的情况下，所产生的绝望行为而设计的一种负性应激实验。在该类型实验中，抑郁动物模型被强迫置于一个装满水的有限的空间内，强迫其进行游泳，在初期动物会对该情况表现出剧烈挣扎的行为，并试图从这种情况中脱离，但在连续性失败后，抑郁动物模型则会选择放弃，保持静止不动状态[13]。研究证明，在强迫游泳实验中，抑郁动物模型因在逃避游泳失败后所表现出来的绝望行为或在面对应激刺激时放弃主动积极应对后所形成的被动消极行为而采取保持静止不动状态[14]。研究指出，抑郁模型动物出现的这种绝望或消极行为与人类受到负性心理应激刺激诱导后所发生的抑郁症状十分相似[15]。强迫游泳实验中的动物模型出现不动状态的持续时间可以用来作为抑郁症的行为学评价指标。临床研究证明，石菖蒲能有效治疗抑郁症患者的绝望行为，因此，强迫游泳实验广泛运用于抗抑郁药物的筛选[16]。抑郁型动物的研究也表明，石菖蒲水煎剂能有效缩短抑郁动物强迫游泳时的不动时间[17]。对石菖蒲主效成分之一的细辛醚的研究表明，细辛醚能显著缓解抑郁型小鼠强迫游泳的不动时间[18]。在给药治疗的第28天，模型组大鼠强迫游泳不动时间显著高于空白组，说明在建模后抑郁型大鼠表现出明显的绝望消极行为，而在给予抑郁型大鼠石菖蒲超临界萃取物灌胃治疗后绝望消极行为得到显著改善，而且这种治疗作用与治疗剂量表现出一定的依赖性，经高剂量的萃取物药液治疗后，大鼠在强迫游泳实验中所表现出的行为与空白组比较差异无统计学意义。因此，强迫游泳实验证明，石菖蒲超临界萃取物药液能有效改善抑郁型大鼠的绝望消极行为。

旷场行动得分实验将一定面积旷场划分出不同的方格区域。实验动物在这种新环境下会表现出由奋、探索再到适应的一系列行为过程。正常的动物在适应新环境的过程中会表现出行动活跃、四处走动等现象，此时动物在旷场内水平跨越多少个方格和抬头观察四周环境的次数会反映其兴奋程度。研究表明，抑郁型大鼠在出现快感缺乏或其他抑郁症状后运动能力及社会交往能力均会出现下降现象，对新环境进行探索行为的能力和侵犯攻击的能力也会出现下降现象[19]。因此，旷场实验能客观反映抑郁型大鼠对新鲜环境的好奇程度、探索能力及其对自身情况的关注，对动物的跨越方格次数和抬头观察环境次数进行评分能更能客观、直接地反映实验动物的兴奋程度，从而判断大鼠的抑郁情况是否发生变化[20-21]。在本实验中，模型组大鼠旷场水平运动得分和垂直运动得分显著低于空白组，说明建模后大鼠的活动能力出现了障碍，对新鲜环境的好奇度和探索能力也下降，对其自身的关注度也有所下降。在对抑郁型大鼠给予石菖蒲超临界萃取物灌胃治疗后，大鼠的旷场水平运动得分和垂直运动得分显著提高，并表现出与药物剂量呈正相关。说明石菖蒲超临界萃取物对抑郁大鼠的运动能力、对新环境的好奇度等行为有显著的治疗效果。

综上所述，在灌胃石菖蒲超临界萃取物药液后，抑郁型大鼠的行为症状得到不同程度的改善，而且这种改善具有一定的剂量依赖性。说明石菖蒲超临界萃取物可以有效改善抑郁型大鼠的行为学的病征。