Nox4在糖尿病及慢性并发症中的作用研究进展

于 婷，李 雷，许 飞，辛 青※

(1.济宁医学院基础医学院生理学教研室，山东 济宁 272067； 2.济宁医学院临床学院诊断学教研室，山东 济宁 272067； 3.济宁市第一人民医院血管外科，山东 济宁 272011)

糖尿病及其慢性并发症的发病率逐年升高，给患者生活和经济带来很大负担。氧化应激在糖尿病及其慢性并发症发病及进展过程中具有重要作用。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases，Nox)家族是催化氧生成活性氧类(reactive oxygen species，ROS)的关键酶。迄今为止，Nox家族包括Nox1～Nox5和双功能氧化酶1、双功能氧化酶2七名成员。各亚型Nox分布在体内不同组织、细胞以及亚细胞结构，生成相应的产物，在生理和病理状态下行使特定功能。Nox4是Nox家族用于生产过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)的唯一亚型，肾脏表达水平最高，也广泛表达于其他类型的细胞，相对其他比较局限的Nox家族成员，具有更广泛的生物功能[1]。对于不同类型的细胞，Nox4的亚细胞定位不同，主要有线粒体、内质网、细胞核及黏着斑。Nox4在缺乏调控亚基或钙升高刺激时始终具有活性，这是Nox4与Nox家族其他成员最主要的区别，可见Nox4来源的ROS水平直接取决于Nox4的表达水平。研究证实，Nox4活性直接受组织氧分压的调控，由Nox4生成的ROS可作为细胞内氧气水平的传感器[2]。现就国内外关于Nox4的基因、结构、激活机制、生物活性，尤其是在糖尿病及其慢性并发症中的改变以及针对Nox4的干预方式，结合最新文献予以综述。

1 Nox的分子生物学特征

人类Nox4基因位于染色体11q14.2～q21上，包括25个外显子。在信使RNA水平已发现4种Nox4剪接体，分别是NoxB、NoxC、NoxD和NoxE，各自负责不同的ROS生成途径及后续的信号转导[3]。在不同细胞中，各种调节Nox4基因表达的转录因子包括转录因子E2F、核转录因子E2相关因子2、缺氧诱导因子-1α、核因子κB、八聚体结合转录因子-1、特异性蛋白3/特异性蛋白1、转录因子c-jun、信号转导及转录激活因子3，结合到Nox4的DNA启动子的特定位点，发挥对Nox4基因转录的调节作用[4]。

完整Nox4蛋白的分子量为66 500，Nox4催化结构域的一级序列包括578个氨基酸，分子量为28 000。Nox4一般位于线粒体和内质网膜上，由跨膜部分和胞质部分组成，人血管内皮细胞的Nox4跨膜部分则位于核质。与Nox家族的Nox1～Nox3类似，Nox4包括6个跨膜α螺旋，由5个环连接，即A～E环，并含有黄素腺嘌呤二核苷酸及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸两个辅基的结合位点的脱氢酶域，作为相对较长的细胞质C端，C环和E环朝向外腔，可能产生ROS，而B环和D环朝向细胞质侧，位于脱氢酶域的同侧。此外，4个保守的组氨酸残基位于第三和第五跨膜螺旋，结合两种不同的亚铁血红素分子，经过两步单电子换元反应陆续对氧分子进行降解[1]。

2 Nox4在糖尿病中的作用

糖尿病以胰岛素分泌缺陷和(或)生物作用受损所致的高血糖为主要表现。1型糖尿病多由自身免疫缺陷、病毒感染、遗传缺陷造成胰岛素分泌不足。2型糖尿病早期多由于胰岛素生物作用受损所致，以胰岛素抵抗为主要表现，也是疾病进展的重要原因，晚期也出现胰岛素分泌不足。

2.1Nox4在胰岛β细胞损伤中的作用 大鼠和人的胰岛细胞都表达部分Nox亚型。体内研究报道，糖尿病大鼠和糖尿病患者胰岛中Nox介导的ROS生成增加，与胰岛细胞功能降低有关，参与糖尿病发病和进展[8]。在高脂肪食物喂养的C57BL/6小鼠中，Nox4抑制剂GLX351322治疗两周可改善非空腹高血糖和糖耐量受损，此效应可在外周血胰岛素敏感性无任何变化的情况下发生。葡萄糖和棕榈酸钠通过增加体外培养的人胰岛细胞ROS含量，抑制胰岛细胞释放胰岛素，而Nox4抑制剂可以拮抗以上效应[9]。肾性高血压大鼠胰腺组织及胰岛细胞Nox4表达升高，通过氧化应激损害胰岛细胞功能，表现为基础胰岛素及葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少，糖耐量降低[10]。

对于体外培养的人胰岛细胞，高选择性Nox4抑制剂GLX7013114减轻促炎细胞因子和高葡萄糖以及棕榈酸对细胞的影响。Nox4参与体外应激诱导的人胰岛细胞凋亡，选择性抑制Nox4可能是治疗2型糖尿病的策略之一[11]。在糖尿病发展过程中，晚期糖基化终末产物在体内的蓄积是导致胰岛细胞功能减退和凋亡的重要因素之一。晚期糖基化终末产物通过上调胰岛细胞Nox4表达，进而增加细胞内ROS含量，促使细胞凋亡[12]。

2.2Nox4在胰岛素抵抗中的作用 不同程度的胰岛素抵抗是2型糖尿病、代谢综合征和肥胖的共同特点，高浓度的葡萄糖和脂肪酸都是胰岛素抵抗的刺激因素，而Nox和氧化应激则可促进多种细胞胰岛素抵抗的形成[13]。当处于过高的葡萄糖和脂肪酸环境下，脂肪细胞主要通过Nox而不是线粒体途径生成ROS，Nox4作为Nox家族在脂肪细胞表达的唯一成员，沉默Nox4基因可抑制ROS生成[14]。

用高脂、高糖饲料喂养脂肪细胞特异性Nox4基因缺失小鼠，较同样方式喂养的C57BL/6小鼠，延迟出现肥胖及胰岛素抵抗，表明脂肪细胞Nox4来源的ROS可能在胰岛素抵抗的发生中起作用[15]。Nox4基因全部敲除小鼠则有其他表现，经过15周高脂饲料喂养，雌性Nox4基因缺失小鼠，较相同方式喂养的野生型小鼠的糖耐量降低，雌性和雄性Nox4基因缺失小鼠，胰岛素敏感指数均与野生型小鼠无显著差异[16]。聚合酶δ作用蛋白2通过稳定p22phox(Nox4亚基)复合物来增强Nox4的活性，促进 Nox4产生H2O2，激活蛋白激酶B，改善2型糖尿病模型小鼠肝脏胰岛素信号通路及糖代谢的紊乱[17]。

3 Nox4在糖尿病慢性并发症中的作用

3.1Nox4在糖尿病肾病中的作用 糖尿病肾病是终末期肾病最常见的病因，20%～40%的糖尿病患者受累[21]。ROS的过量产生是影响糖尿病肾病发病机制的关键事件。在糖尿病状态下，Noxs是细胞质和线粒体产生ROS的主要来源[22]。

Nox4在糖尿病肾病中的作用受到广泛关注。糖尿病肾病患者外周血中Nox4蛋白表达高于正常对照者[23]。1型糖尿病动物模型(链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠和OVE26小鼠)及2型糖尿病动物模型(db/db小鼠)中，肾脏Nox4表达均显著升高。此外，Nox4的膜结合亚基p22phox的表达，在db/db小鼠肾皮质及经高糖培养的肾小球系膜细胞均上调。高糖培养可上调肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞及足细胞的Nox4表达[24]。调控糖尿病肾病中Nox4表达的上游信号通路已被广泛研究。高血糖引起系膜细胞分泌转化生长因子-β1，通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/蛋白激酶C通路上调Nox4表达，导致系膜细胞损伤[25]。高血糖使AMP活化的蛋白激酶失活，上调Nox4，增强Nox活性，通过上调p53的表达和磷酸化诱导体外培养的足细胞凋亡。AMP活化的蛋白激酶激活剂可降低1型糖尿病模型OVE26小鼠肾小球Nox4和p53的表达，防止肾脏增大、肾小球基膜增厚、足突消退和足细胞丢失，使蛋白尿明显减少[26]。诱导型应激蛋白Sestrin2通过AMP活化的蛋白激酶抑制高血糖诱导的Nox4表达，进而限制系膜细胞中Nox4介导的内皮型一氧化氮合酶功能障碍和纤维化[27]。小剂量雷帕霉素可以抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，通过下调Nox4降低足细胞凋亡，减轻肾小球损伤和降低蛋白尿水平[28]。进一步的研究显示，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白C2而非哺乳动物雷帕霉素靶蛋白C1可调控糖尿病状态下Nox4导致的足细胞凋亡[29]。在高糖培养的人肾细胞株HK-2细胞中，过表达微RNA-146a可以抑制Nox4表达、降低ROS的生成、氧化应激和炎症，抑制血管细胞黏附分子-1和细胞内黏附分子-1的表达[30]。此外,许多转录调控因子(核因子κB、磷酸酶-1、缺氧诱导因子-1α、核转录因子E2相关因子2)可在高糖状态下通过与Nox4基因的启动子区结合，上调Nox4基因表达[8]。体内和体外研究证实，早期生长反应因子1也可以作为转录激活因子，上调糖尿病状态下肾脏Nox4的表达[31]。

敲除(C57Bl6/J)小鼠Nox4基因后，通过链脲佐菌素建立糖尿病模型证实，Nox4的缺失可能通过蛋白激酶Cα依赖机制减轻肾损伤[32]。对载脂蛋白(apolipoprotein，apo)E基因缺陷-/-糖尿病小鼠模型的研究发现，Nox4是肾脏ROS的主要来源，沉默Nox4基因导致ROS的产生减少，并下调与糖尿病肾病相关的促炎和促纤维化标志物[33]。条件性敲除足细胞Nox4基因的糖尿病小鼠，肾小球Ⅳ型胶原和纤连蛋白的积聚减少，肾小球硬化和系膜扩张减轻，肾小球基膜厚度下降，尿蛋白减少约50%[34]。达尔盐敏感性大鼠Nox4基因缺陷型(达尔盐敏感性Nox4-/-)与普通达尔盐敏感性大鼠同样注射链脲佐菌素建立糖尿病模型后，达尔盐敏感性Nox4-/-大鼠较达尔盐敏感性大鼠足细胞内Ca2+水平降低，糖尿病肾病相关损伤减少，进一步实验证实，Nox4通过非选择性钙通道瞬时受体电位阳离子通道6调控细胞内Ca2+水平[35]。

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在糖尿病状态下，Nox4可以通过多种下游信号转导通路引起肾脏损伤，如Nox4增加肾脏富马酸盐水合酶(尿液富马酸盐含量调节器)水平，进而通过内质网应激加剧肾小管功能紊乱[36]。Nox4通过增加刺猬因子相互作用蛋白表达，激活转化生长因子β1-Smad2/Smad3级联反应，促进内皮细胞向间质转化，这种转化与内皮细胞纤维化/凋亡相关[37]。

Nox4抑制剂作为一种糖尿病肾病的治疗方式已在实验中显示出较好的效果。Nox1/Nox4抑制剂GKT137831减轻1型糖尿病小鼠(OVE26小鼠)肾小球肥大、系膜基质扩张、尿白蛋白排泄和足细胞损失[38]。GKT137831通过抑制促炎和促纤维化因子，对apoE-/-糖尿病小鼠具有肾脏保护作用[39]。另一种Nox1/Nox4抑制剂GKT136901通过降低2型糖尿病小鼠(db/db小鼠)肾脏硫代戊二酸反应物质水平，减轻肾脏细胞外信号调节激酶1/2磷酸化，进而降低尿白蛋白水平[40]。新型Nox抑制剂APX-115较GKT137831抑制db/db小鼠的肾脏纤维化效果更佳，可见除Nox1/Nox4外，还有其他Nox亚型参与糖尿病肾病状态下的肾脏纤维化改变[41]。APX-115对于链脲佐菌素诱导SD大鼠建立的1型糖尿病动物模型也具有减轻肾脏损伤的作用，且APX-115的肾脏保护作用呈剂量依赖性，30 mg/kg治疗效果最好[42]。

抗氧化剂四甲基哌啶及血管紧张素转化酶抑制剂雷米普利具有下调糖尿病大鼠Nox4表达，降低内质网应激，减轻肾小球损伤的作用[43]。硫化氢通过募集诱导型一氧化氮合酶进而生成一氧化氮，抑制高糖培养的肾近端小管上皮细胞Nox4表达以及基质蛋白积聚[44]。

3.2Nox4在糖尿病大血管病变中的作用 糖尿病大血管病变主要表现为大中血管动脉粥样硬化，动脉壁中层钙化、内膜纤维增生和管腔狭窄是糖尿病患者致死的主要原因之一。Nox4是血管中Nox的主要亚型，在血管壁各层细胞中均大量表达。在糖尿病状态下，Nox4在血管壁各种细胞成分的表达改变与动脉粥样硬化的关系尚存在争议。

对apoE-/-糖尿病小鼠，Nox1基因缺陷具有明显的抗动脉粥样硬化作用，与ROS形成减少、趋化因子表达减弱、白细胞血管黏附以及巨噬细胞浸润、促炎、促纤维化标志物表达减少有关[45]。从Nox4基因缺陷糖尿病apoE-/-小鼠中分离的主动脉平滑肌细胞表现出一种去分化表型，包括收缩基因表达缺失、细胞外基质蛋白生成增加以及Nox1相关ROS水平升高，表明Nox4对糖尿病apoE-/-小鼠的主动脉平滑肌细胞病理生理反应具有抑制作用[46]。

另有研究证实，Nox4上调可促进糖尿病大血管动脉粥样硬化病变，如钙离子非依赖型磷酸酯酶A2的β亚型通过上调巨噬细胞Nox4表达，介导高葡萄糖及低密度脂蛋白培养条件下的巨噬细胞迁移增强，参与糖尿病大血管动脉粥样硬化斑块形成，这种由糖尿病代谢应激诱导的巨噬细胞迁移加速反应，可通过抑制Nox4消除[47]。Nox1/Nox4抑制剂GKT137831对apoE-/-糖尿病小鼠具有减轻主动脉氧化应激，下调单核细胞趋化蛋白1表达，减轻动脉粥样硬化的作用[39]。完整的大鼠主动脉在高糖环境中表现出内皮依赖性血管舒张受损，鞣花酸通过降低细胞外信号调节激酶1/2活性，下调Nox4表达，减少ROS生成，减轻高糖对主动脉内皮功能的影响[48]。胰高血糖素样肽1通过下调糖尿病大鼠主动脉组织Nox4及其辅助亚基p22phox的表达，降低主动脉内皮和平滑肌的转化生长因子-β1水平，减轻主动脉在糖尿病状态下的结构改变[49]。晚期糖基化终末产物通过Nox4加强氧化应激，诱导血管平滑肌细胞凋亡，该效应可被Nox4小干扰RNA抑制[50]。

3.3Nox4在糖尿病心肌病中的作用 糖尿病心肌病是糖尿病患者的一种室性功能障碍，可与冠状动脉疾病或高血压独立存在，增加患者形成心力衰竭的风险。糖尿病心肌病病理改变包括心室壁增厚、心肌细胞肥大、肌纤维减少、胶原沉积、心肌间质纤维化、冠状动脉基底膜增厚和心肌微血管损伤等。Nox4引起的氧化应激与糖尿病心肌病的发生及进展密切相关。

3.4Nox4在糖尿病视网膜病变中的作用 糖尿病视网膜病变是慢性进展性并对视力具有潜在威胁的视网膜微血管疾病，是糖尿病患者最常见的眼部并发症，也是导致青年和中年失明的最常见原因。

对560例糖尿病视网膜病变患者和4 106例未出现视网膜病变的糖尿病患者进行全基因组关联性研究显示，Nox4基因rs10765219和rs11018670单核苷酸多态与糖尿病视网膜病变相关，为Nox4基因参与糖尿病视网膜病变的形成提供了证据[55]。高糖通过激活Notch受体/Nox4/ROS信号通路诱导培养的人视网膜内皮细胞凋亡，采用GKT137831抑制Nox4活性，或Nox4小干扰RNA下调Nox4表达，均能显著降低细胞ROS水平和细胞凋亡[56]。Nox4来源的ROS在ARPE-19人视网膜上皮细胞中参与高糖诱导的血管内皮生长因子高表达，可能通过细胞外信号调节激酶1/2和核因子κB通路实现上述调控作用[57]。大鼠视网膜毛细血管内皮细胞在高糖培养环境下Nox4表达上调，ROS生成增加，细胞活性下降，黄芪甲苷通过下调Nox4表达，恢复ROS平衡，提高细胞活性[58]。

3.5Nox4在糖尿病神经病变中的作用 50%～60%的糖尿病患者可累及糖尿病周围神经病变，表现为渐进性的由远端到近端的末梢神经变性，导致疼痛感觉减退甚至丧失。糖尿病神经病变典型病理改变为轴索断裂及节段性髓鞘变薄或脱髓鞘，引起感觉神经及运动神经传导速度减慢。糖尿病神经病变动物模型周围神经Nox4表达上调，通过加强氧化应激参与周围神经损伤。胰高血糖素样肽1受体激动剂通过p38促分裂原活化的蛋白激酶/核因子κB信号通路下调链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠坐骨神经Nox4表达，减轻糖尿病状态下坐骨神经传导速度损伤及病理改变[59]。

糖尿病是引起认知功能障碍的高危因素，严重的认知损伤可看作是一种糖尿病神经并发症，表现为思维灵活性、智力和信息处理速度下降。糖尿病所致的认知功能障碍与海马Nox4/核因子红系2相关因子2/血红素加氧酶1轴受损有关。多异氰酸酯列克纳胶是溴结构域和外终端域蛋白家族抑制剂，具有调控表观遗传的作用。研究发现，多异氰酸酯列克纳胶通过恢复海马Nox4-核因子红系2相关因子2氧化还原失衡，减轻氧化损伤、炎症和细胞凋亡，改善糖尿病大鼠认知功能。此外，多异氰酸酯列克纳胶对高糖培养的PC-12神经细胞系也起到减少细胞凋亡的作用[60]。

4 针对Nox4的干预方式

许多化合物(如硫醇修饰性化合物、内源性化合物和天然化合物)都具有Nox4抑制作用，但缺乏特异性。白花丹素是一种植物来源的萘醌，可直接与Nox4作用，阻断Nox4活性。由GenKyoTex开发的吡唑并吡啶二酮衍生物GKT137831和GKT136901具有抑制Nox1/Nox4的性质。GKT137831已经在Ⅰ期研究中，另外还计划了糖尿病肾病的Ⅱ期临床试验[61]。采用药效团模型设计、合成并评估新型叔磺酰脲类Nox4抑制剂的研究显示，三种磺酰脲类化合物具有阻断Nox4介导的ROS形成及信号转导作用[62]。

目前，较多的化合物可抑制Nox4活性，但Nox4的抑制机制尚不明确。有研究发现，现有73个化合物具有Nox4抑制作用，如草酰肼、类黄酮、羟吲哚、苯醌和苯并噻吩等，基于这些抑制剂找到4个药效团，有助于未来探索新型Nox4特异性抑制剂[63]。综上所述，Nox4特异性抑制剂可能对糖尿病及其慢性并发症具有治疗作用，但首先需要将这些化合物识别出来。

5 展 望

Nox4是Nox家族的关键成员之一。近10年来，很多研究为探索Nox4的基因、结构、激活机制和生物活性做出了努力。H2O2是Nox4活化的主要产物，并介导了Nox4的主要功能，并在细胞信号转导的多功能性方面解释了Nox4在调节细胞基本功能方面的多重作用。由于Nox4表达具有特异性，受到精细调控，具有不同的活化机制，与Nox家族的其他成员具有相互作用，因此外源性H2O2只能部分地模拟Nox4的生物活动，Nox4在糖尿病及其慢性并发症中的作用尚有待于进一步研究。Nox4可以独立于细胞溶质激活剂而始终具有生物活性，存在一组对Nox4活性具有调节作用的监管蛋白质，为治疗糖尿病及其慢性并发症提供了新的潜在目标和战略。针对Nox4的基因转录干预、蛋白表达调控、蛋白活性调节、特异性阻滞剂的分离与纯化等调节措施的敏感性和特异性评估都是未来的研究方向。