助阳补肺除痹颗粒对肺纤维化大鼠肺组织超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量影响的研究*

胡少丹，仕 丽，孙 峰，刘守华，杨 波，匡 旭，李菁婧

长春中医药大学附属医院肺病科(长春 130021)

间质性肺疾病(Interstitial lung disease,ILD)为呼吸系统疑难病，其致残率、死亡率高、发病率呈上升趋势，肺纤维化作为多种肺部疾病的最终病理结局，西医治疗的局限性和实施难度日渐突出，其中肺纤维化尚无有效治疗药物，激素等治疗毒副反应大。鉴于目前国内、外尚无有效治疗ILD的药物，结合其不断扩大的市场需求，我课题组研制助阳补肺除痹颗粒，针对该病慢性期的治疗，从脾肾阳虚出发，以补肾、温阳、通络为创新点，用于ILD的脾肾阳虚证治疗。具有一定应用前景及应用价值，体现出了中医药治疗的优势，获得了良好的经济效益和社会效益，临床应用疗效显著，本次从实验方面探讨该药治疗肺纤维化的相关问题。肺纤维化(Pulmonary fibrosis，PF)一般指在毒物、自发免疫反应、药物副反应、感染、严重外伤等不同因素刺激下引起的肺部炎症反应，以肺泡表面上皮细胞损伤，炎性细胞累积，成纤维细胞增生，细胞外基质沉积和疤痕形成为主要特征，最终导致正常肺组织结构改变、功能丧失的一类疾病，是间质性肺疾病的终末结局。博来霉素是链霉菌属中抗生素株中提取的糖肤类物质。临床上，博来霉素常用于治疗淋巴瘤、睾丸癌、鳞状细胞癌等。使用博来霉素早期可出现全身炎症反应及类似肺炎症状，而后期则继发严重的肺纤维化。由于其导致动物肺间质纤维化模型与人类肺间质纤维化病理过程相似，所以常被用来制作肺纤维化的动物模型。本实验研究以醋酸泼尼松为阳性对照组，用助阳补肺颗粒进行治疗，观察助阳补肺颗粒对大鼠肺组织中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量的影响。

材料与方法

1 材 料

1.1 实验动物：SPF级Wistar大鼠，180只，体重200～220 g，雌、雄各半。购自辽宁长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK(辽)2015-0001。

1.2 药品与试剂：助阳补肺除痹颗粒(规格：10 g/袋，人用量：10 g/次、3次/d，生产批号：20130301、20170201)，由长春中医药大学附属医院制剂中心提供；醋酸泼尼松片(规格：5 mg/片×100片/瓶，国药准字H12020689，产品批号：131204，天津天药药业股份有限公司)；氯化钠注射液(国药准字H23020501，产品批号：B14081711-2，黑龙江科伦制药有限公司)；注射用盐酸博来霉素(1.5万USP/支/盒，国药准字H20055883，海正辉瑞制药有限公司)。基质金属蛋白酶(Materix metallo ptoteinase,MMP) ELISA检测试剂盒(产品批号：20170901A，美国R&D公司)；SOD用ELISA检测试剂盒(批号：20170901A，美国R&D公司)，MDA用ELISA检测试剂盒(产品批号：20170901A，美国R&D公司)，羟脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)ELISA检测试剂盒(产品批号：20170901A，美国R&D公司)。

2 研究方法

2.1 动物分组：SPF级Wistar大鼠，按体重随机分为6组，每组30只。分别为假手术组、模型组、醋酸泼尼松组，及助阳补肺除痹颗粒高剂量、中剂量和低剂量组。

2.2 模型制备：实验动物购入后常规饲养，适应环境7 d。实验时以10%水合三氯乙醛3 ml/kg腹腔注射将动物麻醉，使其仰卧固定于鼠板，颈部剪毛。常规消毒皮肤，无菌操作下做长约0.5～1cm的颈中切口。逐层剥离暴露气管，然后抬高鼠板头端，使其与实验台面成30～35°角。在直视下用1 ml注射器刺入气管，尽量接近气管分叉处，保持针头与气道方向一致，快速推注注射用盐酸博来霉素(BLEOCIN)加生理盐水溶液0.2 ml(BLEOCIN每支15 mg，使用前以生理盐水配制成浓度为5 mg/ml，按5 mg/kg体重给药)后，立即拔出针头，竖立鼠板，保持大鼠直立体位，左右来回旋转3 min，使药液尽可能到达两侧肺部，分布均匀。缝合皮肤，连续3 d腹腔注射青霉素溶液,防止伤口感染，待动物自然苏醒后置笼内常规饲养。其中，假手术组大鼠手术操作方法与其它各组相同，只是手术后气管内注入等量生理盐水代替盐酸博来霉素。

2.3 给药:各组大鼠自气管内注入盐酸博来霉素建模后第2日起每天灌胃给药1次。醋酸泼尼松组予醋酸泼尼松5 mg/(kg·d)，助阳补肺除痹颗粒高、中、低组分别给予9.28g/(kg·d)、4.64g/(kg·d)、2.32 g/(kg·d)助阳补肺除痹颗粒，连续用药28 d。

2.4 标本采集：分别于造模后第7天、第14天和第28天给药后1 h，每组随机选取10只动物，处死后剖取右侧肺组织，按每克肺组织加9 ml生理盐水，制成10%组织匀浆，3000 r/min离心10 min，取上清。

2.5 检测指标方法：采用分光光度法检测肺组织SOD活力、MDA含量。

结 果

1 助阳补肺除痹颗粒对肺纤维化动物模型肺组织SOD活性的影响 模型组三批动物肺组织中SOD活性在造模后明显低于假手术组(P<0.05)，醋酸泼尼松组动物及助阳补肺除痹颗粒高剂量组三批动物肺组织中SOD活性明显高于同期模型组(P<0.05)，助阳补肺除痹颗粒中剂量组、低剂量组动物肺组织中SOD活性第28天时显著高于同期模型组(P<0.05)。见表1。

表1 助阳补肺除痹颗粒对肺纤维化动物模型肺组织SOD活性的影响

2 助阳补肺除痹颗粒对肺纤维化动物模型肺组织MDA含量的影响 模型组三批动物肺组织中MDA含量则明显高于假手术组(P<0.01)，醋酸泼尼松组动物及助阳补肺除痹颗粒高剂量组三批动物肺组织中MDA含量明显低于同期模型组(P<0.05)，助阳补肺除痹颗粒中剂量组肺组织中MDA含量明显低于同期模型组(P<0.05)，低剂量组动物肺组织中MDA含量第28天时明显低于同期模型组(P<0.05)。见表2。

表2 助阳补肺除痹颗粒对肺纤维化动物模型肺组织MDA含量的影响

3 各组SOD、MDAB情况 本实验结果表明，模型组三批动物肺组织中SOD活性在造模后明显低于假手术组，肺组织中MDA含量则明显高于假手术组。SOD活性随造模时间延长而降低，MDA含量随造模时间延长增加。说明模型动物肺组织中抗自由基的保护系统功能有所降低，间接促进肺纤维化的形成。阳性对照(醋酸泼尼松)组动物及助阳补肺除痹颗粒高剂量(9.28 g/kg)组三批动物肺组织中SOD活性与同期模型组比较均明显增高；而肺组织中MDA含量与同期模型组比较均明显下降。助阳补肺除痹颗粒中剂量(4.64 g/kg)组、低剂量(2.32 g/kg)组动物肺组织中SOD活性于第28天时与同期模型组比较显著增高。助阳补肺除痹颗粒中剂量(4.64 g/kg)组肺组织中MDA含量与同期模型组比较均明显下降，低剂量(2.32 g/kg)组动物肺组织中MDA含量于第28天时与同期模型组比较明显降低。SOD是肺组织的主要抗氧化剂，它分布于细胞表面及胞外基质中，对于保护肺泡细胞及抑制基质的过度重建有重要作用。MDA含量和SOD活力在纤维化阶段有所变化，说明助阳补肺除痹颗粒在成纤维细胞过度增殖并分泌大量胶原的过程中，通过增加肺组织中SOD活性，降低MDA的释放，使肺纤维化进程得到抑制。

讨 论

肺纤维化是一类特殊类型的慢性进展性纤维化间质性肺疾病，肺部成纤维细胞过度增殖导致肺部纤维化和结构改变[1]。肺纤维化是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变，也就是正常的肺泡组织被损坏后经过异常修复导致结构异常即疤痕形成。绝大部分肺纤维化病人病因不明，而该病严重影响人体呼吸功能，轻度肺纤维化时，呼吸困难常在剧烈活动时出现，因此常常被忽视或误诊为其他疾病。当肺纤维化进展时，在静息时也发生呼吸困难，严重的肺纤维化患者可出现进行性呼吸困难，其他症状有干咳、乏力，部分患者有杵状指和发绀。肺组织纤维化的严重后果，导致正常肺组织结构改变，功能丧失，当大量没有气体交换功能的纤维化组织代替肺泡，导致氧不能进入血液。患者呼吸不畅，缺氧、酸中毒、丧失劳动力，严重者最后可致死亡。特发性肺纤维化发病率和死亡率逐年增加，诊断后的平均生存期仅2.8年，死亡率高于大多数肿瘤，被称为一种类肿瘤疾病。发病机制至今尚未完全明确，一般认为是多种因素共同作用的结果[2-3]。其中，活性氧如超氧阴离子及过氧化氢是多种疾病的重要介质，包括肺纤维化。在正常的生理条件下，自由基引发的组织损伤可被内源性抗氧化物质所抑制。然而，当这些抗氧化物不足以对抗大量的氧化物即氧化-抗氧化系统失衡时，组织就会发生不可逆性损伤。博来霉素与铁离子反应可以产生ROS从而损伤蛋白、脂质和DNA，其诱导的肺纤维化包括两个阶段。早期的炎症阶段，大量的炎性细胞如巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞浸润到间质或肺泡中。在随后发生的纤维化阶段，炎症细胞转移到肺部后，因被激活释放过量的氧自由基，除直接引起肺组织的脂质过氧化，启动炎症反应,间接促进纤维化的形成。同时,肺纤维化的动物模型或患者中抗自由基的保护系统功能也有所降低。因此，抑制自由基的产生，清除已产生的自由基及加强抗自由基系统，可以拮抗肺纤维化的进程。早期诊断和治疗对预后有重要意义，而一些有代表性的生物学标志物可用于早期诊断、判断预后及疗效评价[4-5]。

中医学通常将肺纤维化纳入“喘证”“肺痹”的论治范畴，“肺痹”之名始载于《黄帝内经》，属中医“五脏痹”之一[6]。外感邪气侵袭肌表，邪气入里，内干于肺，则发为肺痹[7]。临床表现多为咳嗽、咳痰、喘促、气短、胸闷、乏力、动则尤甚，或见恶寒肢冷、身体疼痛、四肢肿胀、舌质淡、苔白滑、脉沉细无力[8-10]。其病因病机多为风寒湿邪侵袭，痹阻肢体经络，日久正气亏耗、肾气亏虚，或素体阳虚，肺中虚冷，湿浊内生，痹阻肺络，经络不通则为痹矣，治疗上以温肾助阳、补肺通痹为主[11]。助阳补肺除痹颗粒是长春中医药大学附属医院院内制剂，是我课题组王檀教授根据肺痹病因病机，结合多年临证经验自拟而成，由熟地黄、鹿茸、肉桂、炙麻黄、炮姜、人参、炙甘草、桃仁、红花、豨莶草等药物组成，有滋阴补血，益肾填精，散寒除湿，通络散结之功效[12-15]。研究发现，该制剂对于肺纤维化的防治和延缓病情进展有显著作用，通过抑制自由基的产生，清除已产生的自由基及加强抗自由基系统，有效的拮抗肺纤维化的进程，为肺纤维化的治疗开辟新的治疗思路。