白花蛇舌草提取物对卵巢癌模型大鼠的疗效及对其血清性激素水平的影响*
2019-06-14常丰葛马玉瑶孙灵霞葛倩倩
常丰葛,张 珂,马玉瑶,孙灵霞 ,葛倩倩
1.河南省许昌市人民医院妇科(许昌 461000);2.郑州大学第五附属医院妇产科(郑州 450007)
卵巢癌位于妇科恶性肿瘤死亡率第1位,对女性的生命健康有着极大的威胁[1]。目前在卵巢癌的治疗中,主要以手术治疗和化疗为主,但是随着治疗时间的逐渐延长,更多的毒副作用也会慢慢显现出来,机体产生耐药性的问题也日益突出。相关报道指出,中医药不仅能够提高卵巢癌患者的免疫力,还能够使患者放化疗过后的毒副作用减轻,在延长患者寿命、提高患者生活质量上起着至关重要的作用[2-3]。白花蛇舌草属于中药范畴,具有消痈散结、清热解毒和利湿通淋等功效,而且其化学成分中的黄酮类物质还能够对肿瘤的发展产生抑制效果[4]。本文采用白花蛇舌草提取物对卵巢癌大鼠进行干预,旨在探究白花蛇舌草提取物对卵巢癌的作用效果。
材料与方法
1 材 料
1.1 研究对象:选取30只由中国科学院动物中心提供的健康SD大鼠,均为雌性,年龄3~6个月,平均(3.8±1.5)个月,体重200~250g,平均(220±7.9)g。所有大鼠均养殖在干净笼子里,放置在室温(22.3±1.7)℃,相对湿度30%~35%的环境中,每天光照12 h,喂饮大鼠纯净水。饲养时间为1周。本文研究所做实验均获得我院伦理委员会批准。
1.2 主要药物与试剂:白花蛇舌草提取物(购于西安明泽生物科技有限公司);NUTU-19卵巢癌细胞(武汉博士德生物工程有限公司);兔抗大鼠p38抗体(天根生化科技有限公司);小鼠抗大鼠NF-kBp65抗体(上海国药集团化学试剂有限公司);化学发光全自动免疫分析仪及其配套试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司);ELISA试剂盒(武汉默沙克生物科技有限公司)染色剂、PBS缓冲液(均购于武汉博士德生物工程有限公司)。
2 研究方法
2.1 模型建造及分组处理:将30只大鼠随机分为模型组、实验组和空白组,每组各10只。空白组大鼠建模期间不做任何处理;另外两组的20只大鼠均向其右腋下注射NUTU-19卵巢癌细胞0.5 ml,规格为2×102细胞/ml,且注射卵巢癌细胞均处于对数生长期增殖能力最强的细胞,癌细胞浓度越高,建模成功率就越高。因为癌细胞与大鼠机体癌细胞相互接触聚集形成细胞团,当细胞团浓度达到1×106细胞/ml时便为造模成功。当模型组和实验组大鼠体重减轻、毛发干枯、活动能力下降,并且当右下腋窝处肿瘤大小成长到0.4×0.4 cm2时,建模完成。实验组大鼠在建模成功后对其注射白花蛇舌草提取物,1次1 ml/kg,1次/d,连续注射14 d;模型组和空白组大鼠在每天同一时间均给予等体积的生理盐水,连续注射14 d,14 d后对三组大鼠情况进行观察。
2.2 样本采集:将三组大鼠采用端头法处死,取其卵巢组织和卵巢癌组织,为了防止细胞自溶,放入浓度为10%的福尔马林中固定处理24 h,使组织细胞中的蛋白凝固变性。将固定好的卵巢组织和卵巢癌组织用不同梯度的酒精进行脱水处理,去除组织块中的水分,然后再将组织放入二甲苯中进行透明处理。将透明处理过的组织放入融化的石蜡中浸蜡,然后将已经浸透好石蜡的组织块夹取放入包埋盒中,使其冷却凝固。将包埋好的组织蜡块放到切片机上固定,之后进行切片,厚度为5~8 μm,放入40℃的水中展开,然后贴在载玻片上,最后用烘烤箱以60℃的温度烘烤1 h。
2.3 染色处理:对三组大鼠切片样本进行HE染色处理,使用二甲苯进行常规脱蜡处理两次,每次5 min,然后在梯度酒精下水花处理3 min,自来水冲洗1次;使用苏木素染色5 min,自来水冲洗1次;使用浓度为1%的盐酸酒精分化处理30 s,在0.2%氨水中反蓝处理2 min,自来水冲洗1次;在浓度0.5%伊红染色10 min,自来水冲洗1次;使用乙醇梯度进行脱水处理,最后用中性树胶进行封片,使用光学显微镜进行图像分析。
2.4 肿瘤相关指标的测定:对大鼠肿瘤重量平均值、腹水量平均值、肿瘤体积以及抑瘤率进行统计。抑瘤率的计算在大鼠肿瘤剥离称重后,采用抑瘤率计算公式对其进行计算。抑瘤率的计算公式为抑瘤率=(模型组肿瘤重量-实验组肿瘤重量)/模型组肿瘤重量×100%。
2.5 化学发光法检测雌二醇(Estradiol,E2)、孕酮(Progesterone ,P)和促黄体生成素(Luteinizing hormone,LH):待测标本加入化学发光物质,与催化剂发生催化反应,与氧化剂发生氧化反应,形成处于激发状态的之间体,当中间体达到稳定时,会发射出光子,严格按照化学发光分析仪操作步骤,利用发光信号测量仪测量光子数值,对比分析E2、P和LH水平。
2.6 Western blot检测p38、NF-κBp65蛋白相对表达:将采集到的标本,使用PBS缓冲液清洗3遍以上,分离缓冲液,加入IP细胞裂解液,进行裂解35 min,提取总蛋白,BCA测定蛋白浓度。取20 μg/孔蛋白质,通过10%的SDS-PAGE凝胶进行电泳,加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白缓冲液15 min;100 V,电泳10 min,结束之后,将电转膜浸泡在10%的牛奶中,在37℃环境下的摇床上封闭1.5 h;与一抗结合,加入TBST稀释按1:1000稀释一抗Tubulin(内参照),在4℃的环境下孵育过夜保存;第2天用TBST缓冲液清洗,与二抗结合在室温下孵育1 h,再次用TBST缓冲液反复清洗。最后加入显影剂将其仅在底物溶液中进行显色,严格按照显影定影试剂盒操作说明书进行操作,采用目的蛋白条带分析灰度值,目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值=目的蛋白相对表达量。
2.7 酶联免疫吸附测定法检测肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)和白介素-2(Interleukin-2,IL-2)水平:将待测的标本和酶标物严格按照ELISA试剂盒说明书操作步骤与和固相载体产生反应作用,将固相载体反应的复合物经过洗涤与其他物质分离,加入酶反应底物,经过酶的催化作用形成有色物质,根据颜色的深浅进行定性或定量分析TNF-α和IL-2的水平。
结 果
1 三组大鼠病理组织学观察 如图1所示,为三组大鼠经HE染色后显微镜下病理组织图像。图像中可见模型组大鼠肿瘤细胞呈实片状排列,细胞核异型性较大,间质可见肿瘤性纤维组织增生,病理核分裂相易见,局部呈现片状坏死,能够见到瘤巨细胞,在其周围可见炎症细胞浸润。实验组大鼠病理图像中纤维间质减少,且纤维间质内能够见到出血状况,局部可见肿瘤细胞核碎屑,片状肿瘤性坏死,能够看到巨噬细胞。由此可以看出白花蛇舌草提取物对卵巢癌细胞的生长具有抑制作用。
2 三组大鼠肿瘤常规指标比较 如表1所示,实验组大鼠的肿瘤重量平均值、腹水量平均值以及肿瘤体积均显著低于模型组大鼠(P<0.05),且实验组大鼠的抑瘤率明显高于模型组大鼠,组间比较具有统计学差异(P<0.05)。
组 别n肿瘤重量平均值(mg)腹水量平均值(V/ml)肿瘤体积(mm3)抑瘤率(%)空白组10—12.42±0.22——模型组1016.43±0.9282.30±4.1015.36±3.6423.92±2.78实验组109.32±0.8730.25±2.0810.86±2.5143.27±3.63t/F值26.6453.704.8320.07P值<0.05<0.05<0.05<0.05
3 三组大鼠性激素水平比较 如表2所示,实验组大鼠性激素E2、P表达水平明显低于模型组大鼠,LH表达水平明显高于模型组大鼠,差异具有统计学意义(P<0.05)。
4 各指标变化 通过对纳入动物的造模、用药等处理,我们对各组大鼠进行相关指标的观察。通过实验观察发现,中药白花蛇舌草的提取物通过下调p38、NF-kBp65使炎症指标TNF-α和IL-2水平下降,从而抑制卵巢癌细胞的增长。正如表3所示,实验组大鼠p38、NF-kBp65相对蛋白表达量比模型组均显著降低,组内比较具有统计学差异(P<0.05)。同时实验组大鼠TNF-α和IL-2水平比模型组大鼠也明显下调,组间比较具有统计学差异(P<0.05)。上述指标的变化说明白花蛇舌草提取物通过调控p38/NF-kBp65通路使炎症指标降低,从而抑制了实验小鼠肿瘤的发展,由此可见白花蛇草对肿瘤的作用机理具有一定的数据基础。
表2 三组大鼠性激素E2、P和LH水平比较
表3 三组大鼠p38、NF-kBp65相对表达及TNF-α和IL-2水平比较
讨 论
卵巢癌属于中医的“肠蕈”、“癥瘕”、“积聚”等范畴,瘕者,聚散无常,瘕聚成形,推之可移,痛无定处;癥者,固定不移,有形可征,痛有定处。瘕属气病,癥属血病,中医药古籍当中对卵巢癌的发病机制探究也非常常见[5-6]。相关古籍指出,卵巢癌的发生可能是由于风寒湿热之邪内侵、机体正气不足导致,或者是因为房事、情志因素所伤,导致饮食失宜,最终造成肺腑功能失常[7]。日而久之,病人正气持续削弱,气血痰湿相互影响,至单纯的血瘀、气滞或痰湿。在卵巢癌的临床治疗中,中医以攻毒、祛邪、扶正培本为主,明辨虚实也是治疗该病最重要的原则,在疾病初发时期,宜攻宜破;当病人久病不愈或者术后时期,则以补益气血为主,使机体正气得到恢复,如若正气已复仍有血块未除,则需反复攻破[8-9]。
白花蛇舌草属于传统中药范畴,是治疗癌症最常用的药物之一[10]。白花蛇舌草主要生长在我国南方各省潮湿的草地上、田边以及河沟旁,是茜草科耳草属1年生草本植物,中医认为白花蛇舌草性寒,味微苦、甘,归大肠、胃、肝经,具有消痈散结、清热解毒和利湿通淋等功效。已有实验和研究表明白花蛇舌草能够在不同组织起源的肿瘤治疗中发挥其有效性[11]。通过对白花蛇舌草的生物活性和化学成分进行研究,发现白花蛇草中主要包括蒽醌类、黄酮类、有机酸类、香豆精类、多糖类以及生物碱类等[12]。现代药理学指出白花蛇舌草能够抗菌抗炎、抗化学诱变、抗氧化和抗肿瘤等,而白花蛇舌草中抗肿瘤的主要有效成分是生物黄酮,能够对肿瘤细胞的凋亡和DNA合成起抑制作用[13]。白花蛇舌草提取物是一种由白花蛇舌草中的活性成分制成的灭菌水溶液,每毫升的白花蛇舌草提取物中就会含总黄酮25 mg,已有研究证明,白花蛇舌草注射液能对原发性肝癌、食道癌以及生殖系统肿瘤产生治疗效果[14]。
卵巢所产生的甾体类激素以及之间的协调关系能够对女性生殖系统肿瘤发生及病变产生诱导作用,临床中一些卵巢癌患者常常伴有内分泌失调的症状,所以很多研究认为导致内分泌异常的原因是由于卵巢肿瘤对细胞的合成以及激素转换产生较大的抑制作用,间接性地增强了卵巢肿瘤间质细胞的内分泌功能[15-16]。而且机体卵巢组织在发生肿瘤病变会使性激素分泌异常,再加上复杂的胚胎组织学结构,导致肿瘤的产生具有多样性,同时还会分泌出其它的激素[17-18]。在本文研究中,对卵巢癌模型大鼠组织中的性激素指标E2、P和LH进行检测发现,卵巢癌模型大鼠在患病后体内的E2、P和LH表达水平发生异常变化,E2、P水平相比正常大鼠明显升高,LH表达水平明显下降,说明卵巢发生病变后使患病机体的内分泌功能紊乱,导致性激素水平的异常表达。而在对卵巢癌大鼠使用白花蛇舌草提取物进行干预后,患病大鼠体内的性激素水平明显改善,说明白花蛇舌草提取物能够改善卵巢癌大鼠因恶性病变导致的内分泌功能紊乱状态,调节体内的激素分泌水平,控制肿瘤的继续恶化发展。
癌症常被认为是慢性炎症诱导的结构,而且卵巢癌还具有慢性炎症疾病的相似特征。有相关研究指出,TNF-α和IL-2在卵巢癌患病机体中均呈高表达,能够促进肿瘤血管的形成,对肿瘤的转移产生作用。卵巢癌的浸润及转移是一个复杂的、多步骤的、多个相关基因共同参与的过程[19]。p38/NF-kBp65信号通路能够在肿瘤的形成中起到关键作用,p38/NF-kBp65信号通路中具有能够调节肿瘤细胞代谢、增殖、凋亡以及细胞周期进程的p38、NF-kBp65两种核心蛋白,能够对细胞核生长周期进行调控,从而抑制肿瘤转移和生长[20]。NF-kB还能够通过调节炎性细胞因子、黏附因子以及趋化因子的表达,在炎症反应中发挥重要作用[21-23]。我们在设计实验中,使用Western-blot法对不同干预下卵巢癌大鼠p38、NF-kBp65的表达进行检测,并采用酶联免疫吸附测定法对TNF-α和IL-2水平进行检测,可以发现白花蛇舌草提取物干预后的卵巢癌大鼠p38、NF-kBp65表达下调,TNF-α和IL-2水平也随之下降,说明白花蛇舌草提取物能够调控p38/NF-kBp65信号通路,降低炎症指标的水平,从而对大鼠卵巢癌的发展产生抑制作用。
综上所述,白花蛇舌草提取物能够改善卵巢癌大鼠的性激素水平,通过对p38/NF-kBp65信号通路来使机体内的炎症指标下降,从而抑制肿瘤的发展,为临床中卵巢癌的治疗和预后提供理论依据。