严氏温阳化瘀利水方对心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能及肾脏水通道蛋白2表达的影响研究

俞瑞群，乔亮，吴凤珠，张家美

心力衰竭是各种心血管疾病发展的终末阶段，《中国心血管病报告2016》指出我国心力衰竭患病率约为0.9%［1］，China-HF研究［2］显示我国住院心力衰竭患者病死率约为4.1%。心力衰竭具有发病率高、病死率高等特点，已成为威胁我国居民健康的常见病、多发病。中医学理论认为，心力衰竭属“心悸”“水肿”“胸痹”等范畴，多因外邪反复侵袭、劳累过度、脏腑功能失司导致心气、心阳不足。严氏温阳化瘀利水方是全国名中医严世芸教授研制的心力衰竭经验方，其治疗心力衰竭疗效确切［3］，但具体作用机制尚未完全明确。本研究旨在探讨严氏温阳化瘀利水方对心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能及肾脏水通道蛋白2（AQP2）表达的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2018年6—9月完成实验。选取14周龄SPF级SD大鼠60只，平均体质量（200±20）g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物合格证号：SCXK（沪2013-0016）。60只大鼠均在上海中医药大学实验动物中心SPF级适应性饲养1周，人工光照、阴暗各12 h，湿度40%左右。

1.2 主要药物、试剂及仪器

1.2.1 主要药物 严氏温阳化瘀利水方，方剂组成：附子12 g、黄芪30 g、桃仁12 g、川芎10 g、红花6 g、猪苓12 g、茯苓12 g、白术15 g、白芍15 g、桂枝12 g、地龙12 g、泽泻12 g、车前子18 g、当归12 g；坎地沙坦酯片（天津武田药业有限公司生产）。

1.2.2 主要试剂 氨基末端脑钠肽前体（NT-proBNP）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒、SYBR Green聚合酶链反应（PCR）试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒（Thermo Fisher Scientific公司生产），逆转录试剂盒（Fermentas公司生产）。

1.2.3 主要仪器 小动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司生产），心电图机（上海光电医用电子仪器有限公司生产），Vevo 707超声仪（加拿大Visualsonics公司生产），低温冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司生产），电泳仪（Bio-Rad Laboratories生产，型号：Mini Protean 3 Cell）、Realtime检测仪（美国应用生物系统公司生产），电动匀浆机（上海FLUKO机械制造有限公司生产），吉尔森P型移液枪（上海艾研生物科技有限公司生产），芬兰雷勃MK3酶标仪〔通派（上海）生物科技有限公司〕，水浴锅（莱卡公司生产，型号：HI1210），旋涡振荡器（青浦泸西仪器厂生产），电转仪（大连竞迈科技有限公司生产，型号：PS-9）。

1.3 实验方法

1.3.1 分组 将60只大鼠随机分为A组（制备模型，n=45）和B组（假手术，n=15），之后将心肌梗死后心力衰竭制备成功的28只大鼠随机分为A1组（n=9）、A2组（n=10）、A3组（n=9）。A2组大鼠给予坎地沙坦酯片1 mg/kg+蒸馏水2 ml灌胃，1次/d；A3组大鼠给予严氏温阳化瘀利水方常规煎煮后按照人体剂量6.3倍换算后浓缩灌胃，给药体积2 ml，1次/d；B组和A1组大鼠给予等体积蒸馏水灌胃，1次/d。4组大鼠均连续灌胃8周。人和大鼠按体表面积折算后的等效剂量比值为0.018。

1.3.2 模型制备 A组大鼠采用冠状动脉结扎法制备心肌梗死后心力衰竭模型［4］，具体方法如下：给予2.5%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔麻醉大鼠后，仰卧并固定在手术台，行气管插管，连接小动物呼吸机行正压通气，监测大鼠心电图。沿胸骨左侧第3～4肋间切开，扩胸器扩开大鼠胸腔，充分暴露心脏，打开心包，在右心室流出道与左心房之间距主动脉根部2～3 mm处用6-0丝线穿过左冠状动脉主干，连同一小束心肌纤维一起结扎。缝线下方心肌颜色变浅、苍白，结扎即刻心电图检查显示两个及以上导联ST段呈弓背向上抬高＞0.2 mV并持续＞30 min认为心肌梗死模型制备成功，术后腹腔注射青霉素抗感染治疗。心肌梗死模型制备成功后4周行超声心动图检查，若左心室射血分数（1eft ventricular ejection fraction，LVEF）≤45%为心力衰竭模型制备成功。模型制备不成功大鼠弃之不用。B组大鼠在左冠状动脉前降支相同部位穿线但不结扎。

1.4 标本采集 灌胃8周后，取材前所有大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液0.3 ml/100 g麻醉大鼠，采用5 ml促凝管收集腹主动脉血，3 000 r/min离心10 min（离心半径10 cm），留取上清液并置于-80 ℃冰箱保存，用于检测血浆NT-proBNP水平。腹部正中切口，切开皮肤、肌肉、筋膜、腹膜，将肾组织周围内脏推向两侧，迅速取肾脏近髓组织并置于-80 ℃冰箱保存，用于检测肾髓质AQP2及其mRNA。

1.5 观察指标

1.5.1 超声心动图 4组大鼠麻醉后均仰卧固定于操作台，胸前区备皮，采用小动物超声仪（探头频率14MHz）沿胸骨旁左心长轴切面测量左心室舒张末期内径（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左心室收缩末期内径（left ventricular end systolic diameter，LVESD），采用Teichholtz公式计算LVEF、左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS），检测3个心动周期取平均值。

1.5.2 血浆NT-proBNP水平 采用ELISA检测4组大鼠血浆NT-proBNP水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5.3 肾髓质AQP2 采用蛋白印记法检测4组大鼠肾髓质AQP2表达，具体如下：在肾髓质组织中加入裂解液，匀浆器匀浆直至完全裂解。按照BCA蛋白定量试剂盒说明书检测蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳，再转膜至PVDF膜上并封闭，AQP2以1:500稀释抗体，抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，4 ℃孵育24 h，以TBST洗膜，加入1:1 000稀释HRP标记的二抗，37 ℃孵育1 h，采用增强化学发光法检测AQP2相对表达量。

1.5.4 肾髓质AQP2 mRNA 采用实时荧光定量PCR检测肾髓质AQP2 mRNA表达，具体如下：严格按照Trizol试剂盒说明书提取肾髓质组织中总RNA，将总RNA中DNA消除后以反转录法合成cDNA第一条链，再进行实时PCR扩增，采用ABI Prism 7300 SDS Software软件分析肾髓质AQP2 mRNA相对表达量。

1.6 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 超声心动图检查结果及血浆NT-proBNP水平 灌胃8周后，4组大鼠LVEDD、LVEF比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。4组大鼠LVESD、LVFS及血浆NT-proBNP水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；B组、A2组、A3组大鼠LVESD短于A1组，LVFS高于A1组，差异有统计学意义（P＜0.05）；A1组、A2组、A3组大鼠血浆NT-proBNP水平高于B组，A2组、A3组大鼠血浆NT-proBNP水平低于A1组，A3组大鼠血浆NT-proBNP水平高于A2组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

表1 4组大鼠灌胃8周后超声心动图检查结果及血浆NT-proBNP水平比较（±s）Table 1 Comparison of echocardiographic findings and plasma NT-proBNP level after 8 weeks of intervention in the four groups

注：LVEDD=左心室舒张末期内径，LVESD=左心室收缩末期内径，LVEF=左心室射血分数，LVFS=左心室短轴缩短率，NT-proBNP=氨基末端脑钠肽前体；与B组比较，aP＜0.05；与A1组比较，bP＜0.05；与A2组比较，cP＜0.05

组别 只数LVEDD（mm）LVESD（mm）LVEF（%）LVFS（%）NT-proBNP（pg/ml）B组 10 7.7±1.2 4.6±0.8b59.3±9.1 39.7±4.2b 127.6±7.3 A1组 9 9.0±1.0 6.7±1.3 46.5±11.8 24.7±7.1 284.4±5.6a A2组 10 8.0±0.8 5.1±0.9b55.0±11.1 37.4±6.4b158.2±13.4ab A3组 9 8.1±1.0 5.5±1.2b53.7±12.4 32.3±8.3b242.2±13.9abc F值 2.85 6.99 2.15 8.96 156.43 P值 0.05 ＜0.01 0.11 ＜0.01 ＜0.01

2.2 肾髓质AQP2、AQP2 mRNA相对表达量 灌胃8周后，4组大鼠肾髓质AQP2、AQP2 mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；A1组、A2组、A3组大鼠AQP2、AQP2 mRNA相对表达量高于B组，A3组大鼠AQP2、AQP2 mRNA相对表达量低于A1组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表2 4组大鼠灌胃8周后肾髓质AQP2、AQP2 mRNA相对表达量比较（±s）Table 2 Comparison of relative expression quantity of AQP2 and mRNA after 8 weeks of intervention in the four groups

表2 4组大鼠灌胃8周后肾髓质AQP2、AQP2 mRNA相对表达量比较（±s）Table 2 Comparison of relative expression quantity of AQP2 and mRNA after 8 weeks of intervention in the four groups

注：AQP2=水通道蛋白2；与B组比较，aP＜0.05；与A1组比较，bP＜0.05

组别 例数 AQP2 AQP2 mRNA B组 10 2 129.63±1 129.34 0.04±0.04 A1组 9 10 502.71±2 255.90a 0.41±0.12a A2组 10 8 827.67±3 274.54a 0.35±0.11a A3组 9 7 191.62±1 733.23ab 0.28±0.06ab F值 15.66 18.86 P值 ＜0.01 ＜0.01

3 讨论

心力衰竭是心脏收缩功能和/或舒张功能障碍导致静脉系统血液淤积、动脉系统血液灌注不足引发的心脏循环障碍症候群，是临床常见心脏病。中医学理论认为，心力衰竭其标在心，其本在肾，故其主要治疗原则为温肾阳、益心气。严氏温阳化瘀利水方是全国名中医严世芸教授研制的心力衰竭经验方，方中附子温阳化气以治心气虚乏、心阳式微之本，为君药；黄芪、白术益气利水，地龙、桃仁、红花、川芎、白芍活血通络，桂枝泻肺利水，主要治疗气阳虚乏、络脉瘀阻、水湿停聚，共为臣药；猪苓、泽泻、车前子利水消肿，当归补血养心阴以防利水伤正，皆为佐药；全方由真武汤、五苓散和补阳还五汤加减而得，标本兼治，补泻兼施，兼顾气血阴阳。坎地沙坦为血管紧张素Ⅱ AT1受体拮抗剂，其通过与血管平滑肌AT1受体结合而拮抗血管紧张素Ⅱ的血管收缩作用，从而降低末梢血管阻力。既往研究表明，坎地沙坦能有效促进心力衰竭患者心功能恢复，提高患者预后，是辅助治疗心力衰竭的较为理想药物［5］。

LVESD和LVFS可反映左心室收缩功能。脑钠肽（brain natriuretic neptide，BNP）是钠尿肽家族成员，心力衰竭时心室壁张力增加可刺激心肌细胞分泌BNP。既往研究表明，血浆BNP水平与心力衰竭严重程度呈正相关［6］。NT-proBNP是BNP在蛋白酶作用下的裂解产物，其t1/2较BNP长［7］。既往研究表明，NT-proBNP可用于评估心力衰竭严重程度及患者预后［8］。本研究结果显示，灌胃8周后，B组、A2组、A3组大鼠LVESD短于A1组，LVFS高于A1组；A1组、A2组、A3组大鼠血浆NT-proBNP水平高于B组，A2组、A3组大鼠血浆NT-proBNP水平低于A1组，A3组大鼠血浆NT-proBNP水平高于A2组，提示严氏温阳化瘀利水方与坎地沙坦均能有效改善心肌梗死后心力衰竭大鼠左心室收缩功能，但严氏温阳化瘀利水方较坎地沙坦对心力衰竭严重程度的改善效果略差。分析严氏温阳化瘀利水方改善心肌梗死后心力衰竭大鼠左心室收缩功能及减轻心力衰竭严重程度的原因主要如下：严氏温阳化瘀利水方中附子主要成分乌头碱、川乌碱甲、去甲基乌药碱等具有强心、抗心律失常、提高免疫力等作用［9-11］；黄芪补气升阳、利水消肿，黄芪皂苷具有明显强心及保护心肌缺血-再灌注损伤等作用［12］。

水通道蛋白（AQP）是1988年由PETER AGRE教授发现的存在于细胞膜上具有水通透性的蛋白质，其可参与多种器官组织液体转运的病理生理过程［13］。AQP2表达在肾脏集合管主细胞管腔侧膜和胞质囊泡内，且具有调节肾脏水重吸收作用［14］。既往研究表明，慢性心力衰竭患者肾脏AQP2基因表达增加［15］，且AQP2过表达在慢性心力衰竭患者水潴留过程中发挥着重要作用［7］。动物实验证实，茯苓可增加正常大鼠尿量，减少其尿液中AQP2水平及肾髓质中AQP2 mRNA表达［16］；黄芪可降低肝硬化大鼠肾皮髓质AQP2 mRNA表达［17］。本研究结果显示，灌胃8周后，A1组、A2组、A3组大鼠AQP2、AQP2 mRNA相对表达量高于B组，A3组大鼠AQP2、AQP2 mRNA相对表达量低于A1组，提示严氏温阳化瘀利水方与坎地沙坦均能有效下调心肌梗死后心力衰竭大鼠AQP2表达。分析严氏温阳化瘀利水方下调心肌梗死后心力衰竭大鼠AQP2表达主要与严氏温阳化瘀利水方中茯苓、黄芪具有利水作用有关。

综上所述，严氏温阳化瘀利水方能有效改善心肌梗死后心力衰竭大鼠左心室收缩功能，下调肾脏AQP2表达，与坎地沙坦治疗效果相似；但其较坎地沙坦对心力衰竭严重程度的改善效果略差。

作者贡献：俞瑞群进行文章的构思与设计，进行结果分析与解释，负责撰写论文；张家美进行研究的实施与可行性分析，对文章整体负责，监督管理；吴凤珠进行数据收集、整理、分析；乔亮进行论文的修订，负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。