同型半胱氨酸对核因子-κB活性及白三烯E4和前列腺素E2合成水平的影响

王 晶，梅咏玉，丁少桢，袁静静，梅 俏，许建明

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一种病因未明的肠道炎症性疾病。核转录因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)是一类与炎症相关的转录调节因子，参与炎症进程的发生[1]。NF-κB是调节肠道炎症应答的关键靶点，维持肠上皮细胞功能和黏膜完整性[2]。研究[3]表明IBD患者肠黏膜上皮细胞内存在大量激活的NF-κB。IBD患者肠黏膜中白三烯E4(leukotriene E4, LTE4)和前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)水平明显升高[4-5]。LTE4和PGE2是经典的炎症介质，参与炎症的发生发展。同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是一种含巯基氨基酸，可促进炎症介质释放，引起细胞的氧化损伤。Hcy可引起NF-κB发生活化[6-7]。既往研究[8]表明，Hcy可损伤肠上皮细胞功能，引起肠黏膜通透性增加，加重肠道炎症损伤，但Hcy引起肠上皮细胞损伤具体作用机制尚不明确。因此，该研究采用Hcy处理人结肠腺癌(human colon adenocarcinoma,Caco-2)细胞，观察细胞内NF-κB活性及LTE4和PGE2水平变化，探讨Hcy是否通过活化NF-κB信号通路，促进LTE4和PGE2的合成，导致肠黏膜炎症损伤。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和器材Caco-2细胞购自中科院上海细胞所，胎牛血清购自杭州四季青公司，TEMED(四甲基乙二胺)、Hcy和MTT均购自美国Sigma公司，乙二胺四乙酸(EDTA)、蛋白酶抑制剂购自美国Gibco公司，DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司，胞质-核蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒及非放射性试剂盒均购自美国Pierce公司，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所，LTE4及PGE2ELISA试剂盒购自武汉新启迪生物科技公司，Transwell小室购自美国Corning公司，细胞电阻仪购自美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养 待Caco-2贴壁细胞生长至覆盖培养皿底面积80%～90%时，弃上清液，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶消化；收集细胞混悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清液；在Transwell小室或培养板中重悬细胞，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。每隔2 d更换培养基，待4～5 d后观察Caco-2细胞生长情况。

1.2.2给药方法 Hcy临用前以生理盐水溶解，调定pH至7.4，用DMEM完全培养基配制Hcy浓度。

表1 不同浓度Hcy作用不同时间对Caco-2细胞活性的影响

与对照组比较：*P<0.05

表2 不同浓度Hcy作用不同时间对Caco-2细胞LDH水平的影响

与对照组比较：*P<0.05

实验分为对照组，不同浓度Hcy(10、20、50 μmol/L)处理组，药物作用时间分别为1、3、6 h。

1.2.3Caco-2细胞生长检测 将用不同浓度(10、20、50 μmol/L)Hcy处理的Caco-2细胞分别作用1、3、6 h后加入20 μl MTT，4 h后弃上清液，加入150 μl DMSO振荡，根据MTT试剂盒说明方法，检测490 nm处吸光度；将用不同浓度(10、20、50 μmol/L)Hcy处理的Caco-2细胞分别作用1、3、6 h后收集培养液，根据LDH试剂盒说明书方法，检测450 nm处吸光度。

1.2.4Caco-2细胞通透性检测 采用跨膜电阻(transepithelial electrical resistance, TEER)和荧光素-5-异硫氰酸酯(fluorescein-5-isothiocyanate, FITC)跨膜转运量来检测；按实验分组将用Hcy处理的Caco-2细胞分别作用1、3、6 h后，TEER按照细胞电阻仪说明书进行操作；实验开始后，每隔30 min记录一次TEER，并取样于8 ℃冰箱保存，直至6 h结束，采用荧光分光光度计检测425 nm处样品中FITC的荧光值，计算FITC跨膜转运量。

1.2.5Caco-2细胞NF-κB活性检测 细胞生长融合度达到80%时，使用1 ml胰酶消化，以每孔5×105个细胞密度接种，加入1 ml细胞悬液于培养箱(37 ℃、5% CO2)，倒置显微镜观察细胞贴壁后进入实验分组。设对照组，实验组分别为10、20、50 μmol/L Hcy处理组，Hcy处理1、3、6 h后提取细胞核蛋白；根据BCA试剂盒说明方法检测核蛋白浓度；非放射性试剂盒进行电泳迁移率改变实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)。

1.2.6Caco-2细胞上清液LTE4和PGE2的测定 实验设对照组，实验组分别为10、20、50 μmol/L Hcy处理组，Hcy处理1、3、6 h后收集细胞上清液，按照LTE4和PGE2试剂盒操作说明测定两者浓度。

2 结果

2.1 Hcy对Caco-2细胞生长的影响与对照组比较，Hcy处理组Caco-2细胞MTT吸光度明显下降(P<0.05)，见表1，LDH吸光度明显增加(P<0.05)，见表2，均具有浓度依赖性。不同浓度(10、20、50 μmol/L)Hcy对Caco-2生长均具有一定程度的抑制作用，且抑制程度与浓度和作用时间呈正相关性。

2.2 不同浓度Hcy对Caco-2细胞通透性的影响与对照组比较，随着Hcy浓度的增加，FITC的渗透量明显增加(P<0.05)，见图1；TEER的值明显降低(P<0.05)，见图2。不同浓度(10、20、50 μmol/L)Hcy均能影响Caco-2细胞通透性。

图1 不同浓度Hcy作用Caco-2细胞FITC渗透量的变化

图2 不同浓度Hcy作用Caco-2细胞TEER的变化

2.3 50 μmol/L Hcy对Caco-2细胞NF-κB活性的影响与对照组比较，Hcy组细胞NF-κB的DNA结合活性升高(P<0.05)；随作用时间的延长，细胞NF-κB的DNA结合活性升高(P<0.05)，见图3。

图3 Hcy处理Caco-2细胞不同时间NF-κB活性改变

2.4 不同浓度Hcy对Caco-2细胞产生LTE4及PGE2水平的影响与对照组比较，Hcy处理组LTE4和PGE2水平升高，不同浓度组间比较显示，随着Hcy浓度的升高，LTE4和PGE2水平随之升高，见表3。

2.5 Hcy作用不同时间对Caco-2细胞合成LTE4及PGE2水平的影响50 μmol/L Hcy促进Caco-2细胞合成LTE4和PGE2,且在0～6 h内呈一定的时间依赖性(P<0.05)，见表4。

表3 不同浓度Hcy对Caco-2细胞合成LTE4及PGE2水平的影响

与对照组比较：*P<0.05；与10 μmol/L Hcy比较：#P<0.05；与20 μmol/L Hcy比较：△P<0.05

3 讨论

IBD存在肠上皮损伤伴上皮屏障功能失调[9]。NF-κB是真核细胞的一种核转录因子。正常情况下，NF-κB二聚体因与其抑制性亚单位(IκB)结合，以无活性形式存在于细胞质。当被炎症介质及内毒素等刺激后，IκB经过化学修饰作用被蛋白酶水解，NF-κB与IκB解离移至细胞核，与炎症相关物质DNA特定的κB序列结合，启动靶基因转录。NF-κB信号通路是肠道炎症的重要调节机制，参与维持肠上皮屏障功能的完整性[2]。5-脂氧合酶(5-lipoxygenase, 5-LOX)和环氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)是NF-κB重要的作用靶点。当NF-κB受刺激被激活后，促进5-LOX和COX-2过表达，使LTE4和PGE2生成增加，引起炎性活动持续发生[10]。IBD是肠道的一种慢性炎症病变。既往研究[4-5]表明，IBD患者尿液中LTE4和PGE2水平较正常对照组明显升高，一定程度上LTE4可反映肠道炎症程度，PGE2升高程度反映疾病活动度。LTE4和PGE2与炎症关系密切，促进炎症进程的发展。LTE4能引起肠黏膜血管通透性和肠黏液分泌增加，促进肠道炎症的级联放大[11]。PGE2在肠道炎症时，影响肠黏膜血液循环，增加肠黏膜通透性，降低肠黏膜吸收，导致血便和腹泻的发生[5]。

表4 Hcy作用不同时间对Caco-2细胞合成LTE4和PGE2水平的影响

与对照组比较：*P<0.05

Hcy参与蛋氨酸代谢过程，可引起NF-κB活性增强，促进氧化损伤，影响血管内皮细胞屏障，引起炎症介质释放增加，加速动脉粥样硬化的发展[7,12]。此外，Hcy可诱导机体产生白介素-6(interleukin-6, IL-6)[13]和 IL-8等[14]炎性因子对宿主起免疫监视作用。Lazzerini et al[15]发现在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)中，Hcy通过激活NF-κB，刺激IL-6和IL-8合成，参与RA免疫炎症损伤。朱建华等[6]发现在动脉粥样硬化中，Hcy激活NF-κB促进血管平滑肌细胞IL-6合成增加。本研究表明Hcy作用于Caco-2细胞，激活NF-κB，Caco-2细胞中FITC增加和细胞的TEER降低，且呈一定的浓度依赖性，提示Hcy可通过活化NF-κB信号通路，引起Caco-2细胞黏膜屏障功能受损，导致肠黏膜通透性增加。同时，本研究结果显示Hcy作用于Caco-2细胞激活NF-κB，引起LTE4和PGE2合成增加，与课题组前期动物实验结果一致，提示Hcy通过促进炎症介质释放调节肠道炎症过程。

综上所述，Hcy可通过活化NF-κB信号通路，引起Caco-2细胞黏膜通透性增加，促进炎症介质LTE4和PGE2的合成，加重肠黏膜功能损伤，为Hcy在IBD病理生理机制中的作用提供实验依据。同时也为寻找Hcy拮抗剂为临床IBD的诊疗提供新思路。但NF-κB转录因子是否受其上游其他信号通路调控，有待进一步深入研究。