双氧水脱色对油茶粕蛋白结构和功能特性的影响

何玮 郑庆丽 陈健 曹献英

摘  要  为了除去油茶粕蛋白的色素，添加体积分数为4%的双氧水在40 ℃下作用蛋白提取液1 h可取得较好的脱色效果，但双氧水脱色对油茶粕蛋白结构和功能的影响需要进一步研究。本文通过测定变性温度、表面疏水性和巯基的含量，分析红外光谱、X射线衍射峰、微观形貌等研究脱色前后油茶粕蛋白结构和功能的变化。结果显示：双氧水脱色使油茶粕蛋白的表面疏水性上升，巯基含量下降，二硫键含量基本不变;通过红外光谱分析，双氧水脱色减弱了油茶粕蛋白化学键强度，但没有影响油茶粕蛋白基本骨架，微观结构基本相似，油茶粕蛋白的X射线衍射峰的位置和强度基本一致，热变性温度升高，双氧水没有改变油茶粕蛋白的等电点，但油茶粕蛋白的溶解度、乳化性、乳化稳定性、起泡能力和泡沫稳定性均下降，持油性和持水性上升。本研究结果表明双氧水脱色未明显改变油茶粕蛋白的结构，但其功能性质受到一定影响。

关键词  双氧水脱色;油茶粕蛋白质;结构;功能特性中图分类号  TS201.2      文献标识码  A

Abstract  In order to remove the pigment of seed cake protein from Camellia Oleifera， the protein extract was treated with 4% （V/V） hydrogen peroxide at 40 ℃ for 1 h， and a better decolorization effect was obtained. However， the effect of decolorization with hydrogen peroxide on the function and structure of the protein was worthy of discussion. The changes of protein structure and function before and after decolorization were studied by measuring denaturation temperature， surface hydrophobicity and sulfhydryl content， analyzing infrared spectrum， X-ray diffraction peak and microstructure， etc. Decolorization with hydrogen peroxide caused the surface hydrophobicity increased， the sulfhydryl content decreased， and the disulfide bond content remained basically unchanged， and the chemical bond strength weakened. But the basic skeleton， the microstructure， the position and intensity of the X-ray diffraction peak of C. sinensis were basically the same. The heat denaturation temperature increased， the isoelectric point did not change， but the solubility， emulsifying properties， emulsion stability， foaming ability and foam stability of protein decreased， and oil and water holding capacity increased. The results showed that the decolorization of hydrogen peroxide did not significantly affect the protein structure， but its functional properties were affected.

Keywords  hydrogen peroxide decolorization; protein from Camellia Oleifera seed cake; structure; functional properties

DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.022

油茶是我國南方一种特有的油料植物。油茶粕作为油茶榨完油后的主要副产物，其蛋白含量9%～13%[1-2]，油茶粕蛋白含有17种氨基酸成分，其中8种是人体必需的氨基酸，是优质的蛋白资源，极具开发潜力[3]。但油茶经高温热榨后，从剩下的饼粕中提取的蛋白呈深褐色，严重制约了油茶粕蛋白的应用。年贺凤等[4]用双氧水对葡萄籽蛋白脱色，蛋白损失率达21.79%，白度为14.71，表明双氧水对葡萄籽蛋白脱色效果好。杨旭等[5]用双氧水对茶渣蛋白脱色也取得了较好的效果，脱色率达到93.78%，蛋白损失率为44.60%。Xie等[6]采用超声波辅助双氧水对青椒多糖进行脱色，通过高效液相色谱、红外光谱、核磁共振分析表明脱色没有对多糖结构产生明显影响。在本课题组的前期研究中，采用活性炭和大孔吸附树脂等物理吸附方法对油茶粕蛋白质提取液脱色效果不好，利用双氧水的氧化剂特性使有色物质氧化分解成低分子醛、羧酸、二氧化碳类物质，脱色效果明显且脱色后不易复色[7]。本文以油茶粕为原料，碱溶酸沉提取蛋白，在40 ℃条件下，添加体积分数为4%的双氧水对蛋白提取液脱色1 h得到脱色蛋白，对比分析蛋白结构和功能特性的差异，研究双氧水脱色对油茶粕蛋白结构和功能的影响，对脱色油茶粕蛋白进行质量评价，以期为油茶粕蛋白加工及新产品的开发提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  材料與试剂  油茶粕（热压法）：海南省琼海市中原合作社。

三氯乙酸（TCA）、十二烷基磺酸钠（SDS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、甘氨酸，来自北京索莱宝科技有限公司;5，5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB），阿拉丁生化科技有限公司;牛血清白蛋白V标品（BSA），德国BioFROXX有限公司;其余试剂均为国产分析纯。

1.1.2  仪器与设备  AUW-220型电子分析天平，日本岛津公司;DS-1型高速组织破碎机，北京维欣仪奥科技发展有限公司;CR22N型落地式高速冷冻离心机，北京安麦格贸易有限公司;电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司;SCIENTZ-10N型真空冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司;Delta320-S型精密pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司;85-1型磁力加热搅拌器，常州澳华仪器有限公司;Master-EUVF型超纯水机，上海和泰仪器有限公司;752N型紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司;Ultra-Turrax型分散机，德国IKA公司;Q100型差式扫描量热仪（DSC），美国TA仪器公司;AXIS SUPRA型X射线光电子能谱仪（XRD），日本岛津-Kratos公司;Lambda750s型红外光谱仪（IR），美国PE公司;S-3000型扫描式电子显微镜（SEM），日本Hitachi公司。

1.2  方法

1.2.1  油茶粕脱色蛋白的制备  油茶粕破碎后过60目筛，在室温下，油茶粕粉在石油醚中以1∶8的料液比脱脂2 h，此过程重复2次，得到脱脂油茶粕粉。脱脂油茶粕粉在90%的乙醇中以1∶10的料液比磁力搅拌2 h后，40 ℃烘干备用。碱溶酸沉提取油茶粕蛋白，将处理过的油茶粕粉溶于蒸馏水中，调节溶液pH为10，置于50 ℃下磁力搅拌2 h获得蛋白提取液，添加体积分数为4%的双氧水，在40 ℃条件下磁力搅拌1 h，调节油茶粕蛋白溶液pH至等电点3.5，静置30 min后，于6500 r/min离心30 min得到沉淀，经80%乙醇洗涤3次，用超纯水复溶沉淀，装入截留量为8 ku的透析袋中透析，每隔6 h换一次水，透析48 h后冷冻干燥得到蛋白粉末，置于-20 ℃保存。

1.2.2  油茶粕蛋白表面疏水性的测定  参考袁星星等[8]的方法，略作改动。分别取0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mmol/L的SDS溶液1 mL，依次加入20 mL氯仿和5 mL 0.24 g/L亚甲基蓝溶液，混匀后3000 r/min 离心15 min，取底层SDS与亚甲基蓝的混合物，在655 nm波长下测定吸光度。蛋白质的表面疏水性用1 mg蛋白质结合SDS含量（mg/mg）表示。吸光度（y）与SDS浓度（x）的回归方程为y=4.2386x-0.0168（R2=0.9926）。

称取10 mg样品溶于40 mL 0.1 mmol/L SDS溶液，室温搅拌4 h，5000 r/min 离心10 min，上清液透析36 h后，取1 mL透析液与20 mL氯仿混匀，然后在氯仿层中加入5 mL 0.24 g/L亚甲基蓝溶液，充分混匀后3000 r/min离心15 min，取底层SDS与亚甲基蓝的混合物，在655 nm波长下测定吸光度。蛋白质表面疏水性的计算公式如下：

1.2.3  油茶粕蛋白总巯基和游离巯基含量的测定  采用DTNB比色法测定油茶粕蛋白的游离巯基和总巯基的含量[9-10]。称取0.05 g蛋白样品溶解在4 mL 8 mol/L尿素Tris-Gly溶液（pH 8.0），室温磁力搅拌1 h后9000 r/min离心15 min，取上清液作为蛋白液样品，采用双缩脲法测定上清液的蛋白质含量。

（1）游离巯基含量的测定。量取1 mL蛋白液样品，加入5 mL含 8 mol/L尿素的Tris-Gly溶液（pH 8.0）和0.04 mL 4 mg/mL DTNB，在25 ℃下水浴25 min后，于412 nm处测定吸光度B，空白对照中以Tris-Gly 8 mol/L尿素溶液代替蛋白样品液。游离的巯基按照如下公式计算：

式中，D：稀释因子，对游离巯基测定中的D值取6.04;ρ：蛋白质样品的质量浓度（mg/mL）;73.53：106/（1.36×104），其中1.36×104为Ellman试剂的摩尔消光系数[L/（mol·cm）]。

（2）总巯基含量测定。量取0.6 mL的蛋白液样品，加入3.0 mL 8 mol/L Tris-Gly尿素溶液（含pH为8.0的40 mmol/L DTT），在25 ℃下水浴1 h，再加入6 mL 12% TCA，继续在25 ℃下水浴1 h，5000 r/min离心10 min，沉淀物用12% TCA溶液洗涤4次后溶于9.0 mL 8 mol/L Tris-Gly尿素溶液，然后加入0.09 mL 4 mg/mL DTNB溶液，在25 ℃下水浴25 min，于412 nm处测定吸光度B1。总巯基含量计算公式如下：

式中，D：稀释因子，对总巯基测定中的D值取16.15;ρ：蛋白质样品的质量浓度（mg/mL）。

1.2.4  油茶粕蛋白热变性温度的测定  称取2 mg油茶粕蛋白样品，铺在铝盒中压片，置于差式扫描量热仪测试，扫描温度范围为20～180 ℃，升温速率为10 ℃/min，氮气流速50 mL/min[11]。

1.2.5  油茶粕蛋白红外光谱分析  取1 mg油茶粕蛋白样品与100 mg KBr混匀，研钵中研磨10 min，压制成片，置于红外光谱仪中在波长500～ 4000 cm-1区间进行扫描[12]。

1.2.6  油茶粕微观形貌的观察  采用扫描电镜对油茶粕蛋白粉末微观形貌进行观察。操作步骤如下：将冻干后的固体粉末样品均匀平摊在贴有导电胶的样品台上，喷金处理，观察成像时加速电压20 kV[13]。

1.2.7  油茶粕蛋白X射线衍射分析  油茶粕蛋白压制成片，置于用X射线衍射仪中进行测试，扫描范围在2°～55°，速率为3°/min。

1.2.8  油茶粕蛋白溶解度的测定  称取100 mg油茶粕蛋白分散在10 mL蒸馏水中，调节溶液pH分别至2～12，室温振荡30 min，4000 r/min离心20 min，取上清，蛋白含量用双缩脲法测定，每组分别加入10.0 mg/mL BSA 溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，然后分别加入0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.0 mL超纯水，最后加入3 mL双缩脲试剂[14-15]。混匀后，37 ℃水浴30 min，冷却至室温，分别通过紫外分光光度法测定540 nm波长下吸光度值，求3组平均值。建立标准曲线：y=0.0365x-0.0011（R2=0.9997），其中y代表在540 nm下测得的吸光度，x表示蛋白质浓度（mg/mL），溶解度按照下列公式计算：

1.2.9  油茶粕蛋白乳化性及其乳化稳定性  称取60 mg油茶粕蛋白分散在 6 mL 0.01 mol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中，室温下震荡30 min后加入2 mL大豆色拉油，然后在转速20 000 r/min下均质1 min，用移液枪从底部吸取乳状液50 μL，立即与5 mL 0.1% SDS 漩涡混合5 s（以SDS溶液为空白对照），于500 nm处测定吸光度A0。10 min后再次用移液枪从底部吸取50 μL乳状液加入到5 mL 0.1% SDS溶液中，混匀后于500 nm处测定吸光度A1，乳化性及乳化稳定性按照下列公式计算[14-15]：

式中，C：稀释前多肽浓度（g/mL）;φ：光程（1 cm）;θ：形成乳液的油的体积分数（0.25）;DF：稀释倍数 （100）。

式中，A0：0 min時于500 nm处的吸光值;A1：10 min时于500 nm处的吸光值。

1.2.10  油茶粕蛋白起泡性的测定  称取50 mg样品分散在0.01 mol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中，记录初始体积V0，然后使用分散机在转速 10 000 r/min 下分散2 min，并记录此时的体积V1，放置30 min后，记录此时体积V2，起泡性及起泡稳定性按照下式计算[14-15]：

1.2.11  油茶粕蛋白持水性及持油性的测定  称量100 mg蛋白样品于10 mL 离心管中，然后加入2 mL去离子水（或大豆油），漩涡震荡30 s，使得样品与水（或油）充分混匀。室温震荡30 min，4000 r/min离心10 min，除去离心管上层的水（或油），称量离心管和沉淀的质量。蛋白样品的吸水性（或吸油性）可计算为[14-15]：

式中，W0：蛋白样品的质量（g）;W1：离心管与样品的总质量（g）;W2：离心管与沉淀的总质量（g）。

1.3  数据分析

采用DPS9.5软件配对两处理t检验对数据进行差异显著性分析，采用Origin 8.5软件完成绘图。

2  结果与分析

2.1  结构性质的测定

如表1所示，双氧水脱色蛋白的表面疏水性显著高于未脱色蛋白（P<0.05），双氧水脱色蛋白的游离巯基和总硫基含量显著低于未脱色蛋白（P<0.05），二硫键的含量为总巯基含量减去游离巯基含量的1/2，由表1可知脱色前后油茶粕蛋白的二硫键含量变化不大。

2.2  DSC分析

如图1所示，双氧水脱色蛋白和未脱色蛋白的DSC曲线都呈V型，前者的热变性温度为103.25 ℃，后者的热变性温度为100.77 ℃，可能双氧水脱色使得非极性氨基酸侧链增强了氨基酸残基表面空间复杂度大而有序的水合网络，形成聚集体;双氧水脱色使油茶粕蛋白热容增大，大量氨基酸发生缩聚（放热）和重聚合（放热）反应时的温度升高，所以脱色蛋白热变性温度升高。

2.3  红外光谱分析

对双氧水处理前后的蛋白进行红外光谱分析，结果如图2所示，双氧水脱色蛋白与未脱色蛋白都在3600～3200 cm-1出现宽峰，双氧水脱色蛋白在3425 cm-1处强吸收，未脱色蛋白在3358 cm-1处强吸收，表示O-H的伸缩振动，分子间或分子内存在氢键;双氧水脱色蛋白和未脱色蛋白在2932 cm-1处都有吸收峰，表示烷烃—CH2或—CH3的C-H伸缩振动;双氧水脱色蛋白在1653 cm-1处和1543 cm-1处吸收，未脱色蛋白在1657 cm-1和1541 cm-1处吸收，表示 CONH 基团 C=O键伸缩振动，是肽键的特征吸收峰，且N-H对于C=O是反式构型。

2.4  扫描电镜分析

如图3所示，双氧水脱色蛋白与未脱色蛋白从微观形貌上基本相似，在低倍电镜下主要呈片

状结构，这是碱性水溶液提取造成的[15]，在高倍下呈球状，坍塌的球体可能是蛋白质和水组成的颗粒在冷冻干燥过程中不均匀收缩造成的[16]，高倍镜下的双氧水脱色蛋白内部出现部分空隙，总体微观结构变化较小。

2.5  X射线衍射分析

如图4所示，2个样品都出现了3个特征性X射线衍射峰，双氧水脱色的油茶粕蛋白粉末衍射峰分别在5.50°、9.35°、19.13°附近出现，未脱色的油茶粕蛋白粉末衍射峰分别在4.88°、8.62°、19.95°附近出现，油茶粕蛋白X衍射峰的位置与Wang等[17]人研究大豆分离蛋白衍射峰的位置相似。

2.6  溶解度的测定

如图5所示，随pH的增加，pH-溶解度曲线呈先下降后上升的趋势，即呈V型。由图5可知油茶粕蛋白的等电点在pH 3.5左右，双氧水脱色使油茶粕蛋白溶解度下降，但没有改变油茶粕蛋白的等电点。

2.7  功能性质测定

由表2可知，双氧水脱色蛋白的乳化性、乳化稳定性、泡沫稳定性、起泡能力都显著低于未脱色蛋白（P<0.05），双氧水脱色蛋白的持水性和持油性显著优于未脱色蛋白（P<0.05），这与周麟依等[18]研究丙二醛氧化对米糠蛋白功能性质影响的结果相似。

本研究采用体积分数为4%的双氧水在40 ℃条件下对油茶粕蛋白提取液作用1 h，研究双氧水脱色对油茶粕蛋白结构和功能性质的影响。结果表明：双氧水脱色使油茶粕蛋白的表面疏水性上升，可能双氧水使蛋白质结构略微展开，分子内部的一些疏水性的芳香族和脂肪族氨基酸侧链基团暴露到极性溶液中，促进蛋白质折叠，导致表面疏水性增加[19-20]，这与Morzel等[21]的研究结果一致。游离巯基和总巯基含量下降，说明双氧水的脱色使蛋白质巯基发生了氧化，蛋白质巯基的氧化状态分为可逆和不可逆氧化状态，可逆地生成二硫键和次磺酸，不可逆地生成亚磺酸和磺酸，二硫键含量变化不大，说明蛋白巯基氧化状态基本是可逆状态，是可恢复的[22]。

通过IR分析，双氧水脱色减弱了油茶粕蛋白的氢键、C-H伸缩振动强度、C=O键伸缩振动，脱色前后油茶粕蛋白官能团和化学键种类基本一致，脱色没有破坏蛋白质基本骨架，通过DSC分析显示油茶粕蛋白的热变性温度升高，这与邱天福等[23]采用DSC手段研究烷过氧自由基氧化修饰对大豆蛋白变性温度影响的结果相似。SEM结果显示双氧水脱色使油茶粕蛋白内部出现少量空隙，微观形貌改变较小，XRD分析表明双氧水脱色基本没有改变油茶粕蛋白的X射线衍射峰的位置和强度。

本研究结果表明双氧水没有改变油茶粕蛋白的等电点，但油茶粕蛋白的溶解度、乳化性、乳化稳定性下降，可能是蛋白发生共价交联聚集，形成不溶性集体造成的。起泡能力和泡沫稳定性降低，原因可能是雙氧水使油茶粕蛋白不能在气-液界面充分展开，无法形成具有良好粘弹性且能阻隔空气渗透的连续蛋白膜造成的[24]。持油性和持水性上升，可能是油茶粕蛋白氧化程度较低，蛋白空间结构略微张开，蛋白分子柔性增加，较多的水分子有机会进入蛋白内部，从而增加持水性，蛋白暴露出来的部分疏水集团可与脂质结合，增加其持油性[25]。

在本研究特定的脱色条件下，通过对表面疏水性、巯基含量、官能团、热变性温度、X射线衍射峰、微观形貌的测定，表明双氧水脱色对油茶粕蛋白结构影响较小，通过测定油茶粕蛋白溶解度、乳化性、乳化稳定性、起泡能力、泡沫稳定性、等电点、持油性和持水性，表明双氧水脱色对油茶粕蛋白的功能性质有一定的影响，但其理化性质等电点没有改变。综合考虑，可以采用体积分数为4%的双氧水在40 ℃条件下对油茶粕蛋白提取液作用1 h除去油茶粕蛋白的深褐色。

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