2个荔枝品种体胚发生过程中糖含量及相关酶活性变化

吉训志 李焕苓 王果 高兆银 孙进华 王家保

摘  要  为研究糖代谢在荔枝体胚发生过程中的作用，将‘大丁香和‘新球蜜荔胚性愈伤组织接种在TD培养基上，并将‘新球蜜荔接种在TX培养基上，对比体胚诱导过程中3种胚性培养物之间淀粉、蔗糖等糖组分及其代谢相关酶活性变化，以期从糖代谢方面找出影响荔枝体胚发生效率差异的关键因素。结果表明：在体胚发生过程中，‘新球蜜荔在2种培养基上的淀粉含量都低于‘大丁香;三者的葡萄糖与果糖含量变化相似，但‘大丁香都高于‘新球蜜荔，而‘新球蜜荔的蔗糖含量则高于‘大丁香;‘新球蜜荔的淀粉酶、β-淀粉酶活性都高于‘大丁香，而α-淀粉酶活性相似。‘新球蜜荔的蔗糖合酶及在TD培养基上的酸性转化酶活性高于‘大丁香，但中性转化酶活性是以‘大丁香偏高，且‘新球蜜荔在TX培养基上也以中性转化酶为主。由此‘新球蜜荔通过淀粉酶、蔗糖合酶及轉化酶将淀粉转化成蔗糖为体胚发生提供物质能量，而高活性的中性转化酶与低活性的淀粉酶，使‘大丁香的蔗糖没有得到积累，使其体胚发生效率低于‘新球蜜荔。

关键词  荔枝;体胚发生;糖代谢;酶活性中图分类号  S667.1      文献标识码  A

Abstract  In order to investigate the effect of sugar metabolism on the somatic embryogenesis of litchi， embryonic callus of ‘Dadingxiang and ‘Xinqiumili were inoculated on TD medium， respectively， and the embryonic callus of ‘Xinqiumili was inoculated on TX medium. Contents of starch， sucrose and other sugar components and activities of the metabolism-related enzymes were compared among the three embryonic cultures. The results showed that starch content on TD and TX medium in ‘Xinqiumili were lower than that in ‘Dadingxiang during somatic embryogenesis. All the glucose and fructose content were similar， but glucose and fructose contents in ‘Dadingxiang was higher than that in ‘Xinqiumili， while sucrose content in ‘Xinqiumili was higher than that in ‘Dadingxiang. The activity of amylase and β-amylase in ‘Xinqiumili were higher than that in ‘Dadingxiang， but the α-amylase activity in ‘Xinqiumili and ‘Dadingxiang were similar. The activity of sucrose synthase and acid invertase on TD medium in ‘Xinqiumili were higher than that in ‘Dadingxiang， but neutral invertase activity in ‘Dadingxiang was higher than that in ‘Xinqiumili， and also the dominant by neutral invertase on TX medium in ‘Xinqiumili. Through converted the starch into the sucrose by amylase， sucrose synthase and invertase in ‘Xinqiumili was provided material energy for somatic embryogenesis， while high neutral invertase activity and low amylase activity in ‘Dadingxiang can not accumulation of sucrose， maked the efficiency of somatic embryogenesis in ‘Dadingxiang was lower than that in ‘Xinqiumili.

Keywords  litchi （Litchi chinensis Sonn.）; somatic embryogenesis; carbohydrate metabolism; enzyme activity

DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.008

在植物体胚发生过程中，糖既作为能量物质提供碳源，也作为一种渗透调节剂，加大细胞内渗透压，促进细胞吸收营养用于生长代谢。糖代谢相关酶通过对糖组分进行调控，能够影响植物体胚发生[1]。蔗糖还作为一种信号分子在植物体胚发生过程中起调控作用。在培养基中通过添加不同浓度的蔗糖，可以调节体胚发生的能力与质量[2-3]。在植物发育的过程中，植物组织中淀粉及各种糖组分变化不同，与糖代谢相关的酶如中性转化酶、酸性转化酶、蔗糖合酶与淀粉酶等，其活性也是多种变化，表明糖代谢调控网络在植物发育过程中发挥着重要作用[4]。在人参[5]、棕榈[6]、桫椤[7]、沙地云杉[8]和楸树[9]对其体胚发生的研究中，发现淀粉与糖含量变化与其体胚发生密切相关，但是未从糖代谢方面进一步揭示其对于体胚发生的影响，并且尚未有研究糖代谢与荔枝体胚发生关系的报道。本研究旨在通过研究糖代谢相关生理变化机制，弄清糖代谢相关酶与糖组分含量变化对荔枝体胚发生的影响，为从糖代谢方面调控荔枝体胚发生效率提供理论基础。

笔者们前期在对2个荔枝品种胚性愈伤组织进行体胚诱导的研究中发现，‘新球蜜荔荔枝品种在TD培养基上培养第9天开始出现球形胚，在TD与TX培养基上培养第12天开始出现心形胚，两者都在培养15～18 d中出现鱼雷形胚，并且体胚大量出现，而‘大丁香荔枝品种在TD培养基上培养第15天出现心形胚，培养第18天出现畸形胚，但未见体胚大量出现[10]。本研究拟对比2个荔枝品种上述体胚发生过程中培养物的糖组分及糖代谢相关酶类变化，探讨这些变化与体胚发生的关系，以期为荔枝体胚发生机制研究提供基础。

1  材料与方法

1.1  材料

挑取事先培养在含2，4-D和KT的MS培养基上的‘新球蜜荔和‘大丁香2个荔枝品种胚性愈伤组织，接种在TD培養基（MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L TDZ+0.1 g/L肌醇+0.4 g/L水解乳蛋白（LH）+100 mL/L椰汁+60 g/L蔗糖+10 g/L琼脂）上，再将同样的‘新球蜜荔胚性愈伤组织接种在TX培养基（MS+0.1 mg/L NAA+5 mg/L ZT+0.1 g/L肌醇+0.4 g/L水解乳蛋白（LH）+100 mL/L椰汁+60 g/L蔗糖+10 g/L琼脂）上，详见表1。从开始接种在TD和TX培养基上为0 d，此后培养第6、9、12、15、18天进行取样并进行冻存[11]。实验重复3批次。

1.2  方法

1.2.1  淀粉及蔗糖、葡萄糖与果糖含量测定  淀粉提取与测定参照赖钟雄等[12]的方法，取待测材料0.1 g，用碘-淀粉比色法测定样品中的淀粉含量，重复3次。

蔗糖等糖组分提取参照杨俊等[13]的方法并稍做改动：取待测材料0.5 g，加入1 mL的80%乙醇，参照上述研磨步骤，将上清液进行冷冻高压抽干后，用0.5 mL的超纯水重新溶解，于0.45 μm微孔滤膜进行过滤，-20 ℃保存备用。

色谱分离条件：色谱柱为Waters色谱柱（Xbridge Amide 3.5 mm 250 mm×4.6 mm），柱温为30 ℃，进样体积为10 μL。流动相：乙腈（色谱纯）与超纯水（含0.2%浓氨水）的体积比为75∶25，流速为1.0 mL/min，进行洗脱。蒸发光散射检测器（3300，美国Alltech）温度设置为80 ℃，氮气流速为2.0 L/min，增益为2。运用empower2软件进行仪器控制，数据收集与处理。将样品测定出各种糖的峰面积，分别参照对应的标准曲线回归方程，推算出样品中各种糖含量。

1.2.2  淀粉代谢相关酶活性的测定  参照黄浅[14]的方法并改动。取待测材料0.1 g，加入1 mL蒸馏水，参照上述步骤研磨，制取粗酶液备用。通过测定淀粉分解成还原糖含量来表示淀粉酶活性，α-淀粉酶是事先在70 ℃水浴保温15 min后，进行测定得到结果。β-淀粉酶活性以淀粉酶活性减去α-淀粉酶活性表示。

1.2.3  蔗糖代谢相关酶活性的测定  糖代谢相关酶测定参照武红霞等[4]的方法，取待测材料0.1 g，通过测定蔗糖转化成还原糖的含量来表示酸性转化酶与中性转化酶的活性，而将单糖底物反应30 min再消解后测定总糖含量来表示蔗糖合成酶的活性。

1.3  数据处理

实验数据利用IBM SPSS statistics 25.0软件进行单因素方差分析（ANOVA），采用LSD（least significant difference）和Duncan法对处理之间以及同一处理随时间变化的差异显著性进行比较，并用Microsoft Excel 2010软件制作图表。

2  结果与分析

2.1  淀粉及蔗糖、葡萄糖与果糖含量变化

XQTD和XQTX的淀粉含量变化都呈不断下降的趋势，DDXTD的淀粉含量变化呈先下降后上升再下降的趋势（图1A）。XQTD的淀粉含量稍微高于XQTX，但在第18天，XQTX高于XQTD，而DDXTD在第0～6天期间低于XQTD，但从第9天开始，DDXTD急剧上升并高于XQTD。

XQTX、XQTD及DDXTD的蔗糖含量变化都呈先升后降的趋势（图1B）。XQTX在第6天到达峰值，而XQTD在第9天到达峰值，但XQTX高于XQTD。DDXTD在第9天到达最高，并在第6～12天的培养中均低于XQTD，但在第18天，DDXTD上升，并超过XQTD。

XQTX、XQTD及DDXTD的葡萄糖与果糖含量变化都整体呈上升的趋势（图1C，图1D）。在第18天，XQTD的葡萄糖与果糖含量都高于XQTX。DDXTD是从第6天开始增长幅度变大，并且在前15 d的培养时间里都高于XQTD，但在第18天，DDXTD与XQTD差异不显著。

2.2  糖代谢相关酶活性变化

2.2.1  淀粉代谢相关酶活性变化  DDXTD与XQTD的淀粉酶（AMY）与β-淀粉酶（β-AMY）活性变化都呈先升后降的趋势，XQTX的淀粉酶（AMY）及β-淀粉酶（β-AMY）活性呈先上升后平缓的趋势（图2A，图2B）。XQTX的这2种酶活性都从第9天开始高于XQTD。DDXTD与XQTD的AMY活性都在第15天达到最高，DDXTD的β-AMY则是在第12天达到最高，不过XQTD的这2种酶活性都比DDXTD高。

XQTD的α-淀粉酶（α-AMY）活性呈不断上升的趋势，XQTX的α-AMY活性有2个峰，

DDXTD的α-AMY活性变化呈先降后升再降的趋势（图2C）。在第15天，XQTX高于XQTD，而在第18天时，XQTD高于XQTX。并在第6天时，DDXTD低于XQTD，随后DDXTD上升，并从第9天开始高于XQTD，并达到峰值，在第12～18天期间下降，第18天时，两者的α-AMY活性差异不显著。

2.2.2  蔗糖代谢相关酶活性变化  XQTD的蔗糖合成酶（SS）活性变化呈先升后降的趋势，XQTX的SS活性呈先升后降再升的趋势，DDXTD的SS活性变化呈先升后降再升的趋势（图2D）。三者都在第6天到达最高点，不过XQTD的SS活性高于XQTX及DDXTD，但在第18天时，三者的SS活性差异不显著。

XQTD的酸性转化酶（AI）活性变化呈不断上升的趋势，而XQTX的AI活性有2个峰值，DDXTD的AI活性变化呈先下降后上升的趋势（图2E）。从第9天开始，XQTD就一直高于XQTX。在第0天时，DDXTD远高于XQTD，但随后DDXTD急剧下降，并低于XQTD，第15天时DDXTD的AI活性又上升，与XQTD差异不显著。

XQTD的中性转化酶（NI）活性变化呈先降后升的趋势，而XQTX的NI活性呈先升后降，DDXTD的NI活性变化呈下降趋势（图2F）。在第9天时，XQTD的NI活性达到最低，而XQTX则是第15天出现单峰。DDXTD一直都高于XQTD。

3  讨论

糖与淀粉是植物细胞在生长发育过程中供能与储能的重要碳水化合物，体胚发生是植物细胞脱分化和再分化的过程，而糖代谢途径在这过程中起着为体胚发生提供物质能量的作用[15-16]。糖代谢的基本途径是植物细胞在淀粉酶的作用下将淀粉转化为蔗糖，蔗糖在转化酶与蔗糖合酶的作用下进一步转化为葡萄糖和果糖供给细胞用于生命活动，葡萄糖和果糖也能在蔗糖合酶的作用下合成蔗糖储存起来。

在本研究中，‘新球蜜荔从9 d开始出现体胚，蔗糖合酶活性在第6天出现峰值，蔗糖含量在第9天达到峰值，而‘大丁香的蔗糖合酶与蔗糖含量都低于‘新球蜜荔，表明蔗糖含量的积累是荔枝体胚发生的前提。在12 d时，‘新球蜜荔出现心形胚结构，淀粉酶活性达到峰值，酸性转化酶活性高于‘大丁香，蔗糖含量下降，果糖与葡萄糖含量上升，表明随着荔枝体胚发生并进一步分化，果糖与葡萄糖作为碳骨架物质，参与了体胚结构的发育。此后‘新球蜜荔的体胚进一步发育成鱼雷型胚结构，果糖与葡萄糖含量不断上升，并且‘大丁香也开始出现体胚，两者的糖组分含量相似，不过‘大丁香仍保持高含量的淀粉，而这可能是抑制‘大丁香体胚发生的原因之一。

花生体胚发生中在胚性细胞时期有淀粉积累高峰[17]，在柑桔体胚发生的研究中也有类似现象出现[18]。在对龙眼体胚发生的研究中发现淀粉在体胚发生早期的胚性愈伤组织阶段有累积高峰，并在体胚发生过程中含量减少为其他物质合成提供物质能量[19]。这些现象与本试验出现的情况一致，在体胚发生过程中淀粉含量，‘新球蜜荔在培养开始时就具备了高含量的淀粉，并随着体胚发生而不断下降，但‘大丁香的淀粉含量则是不断上升，体胚发生少量且晚，表明淀粉在荔枝体胚发生过程中起着重要作用。在培养中，‘大丁香的蔗糖含量低于‘新球蜜荔，而果糖与葡萄糖的含量高于‘新球蜜荔，这可能与‘大丁香需要消耗大量蔗糖来增殖愈伤组织有关。而‘大丁香的淀粉酶活性低于‘新球蜜荔，中性轉化酶活性高于‘新球蜜荔，而酸性转化酶与蔗糖合酶都低于‘新球蜜荔，表明在糖代谢过程中不同品种在体胚发生中主要起作用的糖代谢相关酶活类型不同，在转化酶中‘新球蜜荔在TX培养基上与‘大丁香都以中性转化酶为主，而‘新球蜜荔在TD培养基上则是以酸性转化酶为主。这些酶造成‘大丁香与‘新球蜜荔的糖组分含量差异，可能与‘大丁香及‘新球蜜荔的体胚发生能力存在差异有关。

4  结论

‘新球蜜荔以淀粉酶、蔗糖合酶及转化酶的糖代谢系统，有序地对淀粉与糖组分进行正常的调控，使‘新球蜜荔体胚发生早且大量。而‘大丁香的淀粉含量则不断上升，淀粉酶及蔗糖合酶活性也低于‘新球蜜荔，使得‘大丁香以增殖愈伤组织为主，表明淀粉含量与糖代谢相关酶活变化对荔枝体胚发生密切相关。

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