肝纤维化患者Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ的表达水平及其临床意义

黎武 宋劲松

肝纤维化即肝细胞因炎症或坏死而诱导的肝脏内纤维结缔组织异常增生的过程，是肝硬化的重要病理基础[1-2]。N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸( N-acetyl-ser-yl-aspartyl-lysyl-proline，Ac-SDKP)是一种短肽，是某些致纤维化细胞因子的重要上游激活因子，与肺及其他组织纤维化病理改变存在密切联系[3]。Smad7是转化生长因子-β(TGF-β)信号路径的一种负调节因子，可诱导TGF-β活化，导致肝星状细胞向成纤维细胞转化[4]。过氧化酶活化增生受体γ抗体(PPAR- γ)是配体激活核转录因子家族成员之一，是炎症、动脉粥样硬化等多种病理生理改变的调控因子。本研究观察肝纤维化患者的Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ的表达水平，并分析其临床意义。

资料与方法

一、 患者一般资料

选取2017年2月至2018年2月在我院接受治疗的肝纤维化患者。纳入标准：(1)年龄≥18周岁；(2)经影像学检查确诊为肝纤维化；(3)未合并其他系统疾病；排除标准：(1)相关资料不全者；(2)伴肝癌者。参照前述标准共纳入80例患者，其中男55例，女25例，年龄41～82岁，平均(54.85±3.22)岁，肝硬化病程4～15年，平均(8.35±1.47)年；对照组纳入标准：(1)年龄≥18周岁；(2)影像学检测显示肝囊肿；(3)未合并其他系统疾病，共纳入80例，男45例，女35例，年龄45～75岁，平均(56.88±3.27)岁。两组年龄、性别等一般资料具有可比性。本研究经医院伦理委员会评审通过，且所有患者均知情同意。

二、方法

对所有患者进行穿刺活检，将10 mg病理样本打碎制备为悬液，3 500 r/min，12 cm半径，离心10 min后，滴入10%血清置于温箱内进行传代培养，取部分样本转染Smad7，并将其稀释至96孔板内培养24 h，随后选取Western blot法检测Smad7表达水平，相关试剂由上海生工提供，操作参照说明书进行。

将10 mg病理样本常规切片，并用2%APES处理10 min，枸橼酸盐缓冲液修复抗原。同时将PPAR-γ抗体稀释为1∶100，以PBS为一抗阴性对照，以PPAR-γ为阳性对照，根据美国Santa Cruz公司提供的PPAR-γ试剂盒说明书进行免疫组织化学一步法检测。

将10 mg病理样本打碎，滴入2 mL PBS进行匀浆，置于-25 ℃温箱内过夜，以破坏细胞膜。低温3 500 r/min离心6 min，取上清，参照上海易汇生物科技有限公司提供的Ac-SDKP ELISA试剂盒进行检测。同时选用北京普朗(集团)有限公司生产的PUZS-300普朗全自动生化分析仪检测患者肝功能指标。并选用ELISA法检测患者TGF-β1、TNF-α和IL-6水平，试剂盒由武汉默沙克生物科技有限公司提供，参照说明书进行操作。

三、评价指标

观察两组患者肝组织Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ相对表达量，比较两组肝功能指标(ALT、AST和Alb)、细胞因子(TGF-β1、TNF-α和IL-6)水平的差异，分析肝纤维化患者Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ表达水平与肝功能和细胞因子水平的相关性。

四、统计学处理

数据录入后，采用SPSS 11.5软件进行分析。计数和计量资料则应用例和均数±标准差进行处理。选用t检验对患者肝组织Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ等细胞因子表达水平进行分析，同时借助Pearson相关分析法分析肝纤维化患者Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ表达水平与肝功能间的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、两组患者肝组织Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ相对表达量比较肝纤维化患者肝组织Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ相对表达量低于对照组(P均<0.001)。见表1。

表1 两组患者肝组织Ac-SDKP、Smad7

二、两组患者肝功能指标比较

肝纤维化患者的ALT、AST水平均高于对照组(P均<0.001)。见表2。

表2 两组患者肝功能指标的比较

三、两组患者细胞因子水平的比较

肝纤维化患者TGF-β1、TNF-α和IL-6水平均高于对照组(P均<0.001)。见表3。

表3 两组患者细胞因子水平的比较

四、肝纤维化患者Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ与肝功能和细胞因子的相关性

肝纤维化患者的Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ表达量与ALT、AST、Alb、TGF-β1、TNF-α和IL-6水平负相关(P均<0.05)。

讨 论

本研究中，肝纤维化患者TGF-β1水平显著高于对照组，证实TGF-β1是肝纤维化的重要危险因子。既往研究显示，TNF-α和IL-6也是肝纤维化的重要参与因子，这与该两种物质介导的炎症反应有关[5]。本研究中，肝纤维化患者TNF-α和IL-6水平高于对照组。有研究发现TNF-α还可促大鼠肝细胞合成大量胶原蛋白及蛋白多糖；而IL-6则对Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白具有促进作用[6]，表明TNF-α和IL-6还可通过影响细胞外基质合成、降解来参与肝纤维化。

Smad7作为TGF-β信号转导的负调控因子，可有效阻滞TGF-β信号的转导。肝脏损伤时，自分泌TGF-β激活肝星状细胞，同时TGF-β可促使Smad7一过性高表达，以实现TGF-β/Smads信号通路的正负平衡[7]。而Smad7的活化将抑制TGF-β受体TR1对Smad7家族成员Smad2、Smad3的磷酸化，同时促进TR1的自降解，阻滞TGF-β信号转导。提示Smad7对TGF-β具有负反馈调节能力。本研究中，肝纤维化患者肝组织Smad7相对表达量高于对照组，这与Smad7的TGF-β负反馈调节能力有关。Ac-SDKP具有促细胞黏附、促炎性细胞趋化以及降解细胞外基质功能。Ac-SDKP可抑制AngⅡ诱导的肌成纤维细胞增殖、分化能力，同时还可抑制Ⅰ型胶原蛋白的表达[8]。本研究中，肝纤维化患者肝组织Ac-SDKP相对表达量高于对照组，说明肝纤维化患者Ac-SDKP应激性增高。PPAR-γ具有多种生物活性，其在炎症、细胞质增殖、细胞凋亡、脂质代谢等生理活动中发挥重要作用[9]。本研究中，肝纤维化患者肝组织PPAR-γ相对表达量高于对照组，表明PPAR-γ与肝纤维化密切相关。肝纤维化大鼠PPAR-γ可通过抑制FAK下游PI3K/AKT信号通路的激活，并以此抑制纤维化发展，这可能是本研究中肝纤维化患者肝组织PPAR-γ相对高表达的原因[10]。随后的相关性研究显示，肝纤维化患者的Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ表达量与ALT、AST、TGF-β1、TNF-α和IL-6水平负相关，表明肝纤维化患者疾病严重程度与其Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ水平相关，提示Ac-SDKP、Smad7和PPAR-γ或可成为肝纤维化诊断及严重程度评估的重要指标。