丰富生存环境通过调节IL-22信号路抑制小鼠肝纤维化

刘婷婷 张伟 李泽方 蒙姿宏 屠红 甘愉

肝纤维化作为慢性肝损伤的修复反应，是慢性肝病向肝硬化、肝癌发展的必经中间环节和可逆阶段[1]。近年来研究发现，多种免疫细胞及细胞因子构成的免疫微环境在肝纤维化发生、发展中扮演着重要的角色。IL-22作为其中的一种细胞因子，可以与IL-22RA1和IL-10RA2组成的异源二聚体受体结合，在肝纤维化过程中发挥保护和促进组织修复的作用[2]。

肝脏作为机体应激反应明显的器官之一，有关心理应激与肝病关系的研究目前多集中在肝病发生之后患者抑郁情绪的产生和加重[3-4]，而心理情绪对肝病发生发展的影响，尤其是良性心理应激对肝脏病理过程的作用，国内外研究较少。EE是目前普遍接受的良性心理应激模型，它比SE具有更大的空间，更多的小鼠成员和更为多样新奇的玩具设施，给小鼠提供了更多的社交机会和运动刺激，较好的模拟了人们生活中的社交、运动、适度生存挑战的状态。

本研究中，我们将EE模型引入对肝纤维化的研究中，在成功构建EE诱导的良性心理应激模型的基础上，进一步建立CCl4诱导的肝纤维化模型，以期探究EE对小鼠肝纤维化发生发展的影响及作用机制，为临床提供新的诊疗思路。

资料与方法

一、材料

(一)动物 野生型雄性3周龄C57BL/6小鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016]。所有动物饲养操作规范符合上海市肿瘤研究所医学动物委员会的指导方法。

(二)主要试剂 CCl4购自国药集团化学试剂有限公司，橄榄油购自生工生物工程(上海)有限公司，高架十字迷宫和SuperMaze软件购自上海欣软信息科技有限公司，ALT试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司，苏木素染色液购自北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司，伊红染色液购自上海源叶生物科技有限公司，Sirius Red染色液购自武汉赛维尔生物科技有限公司，ELISA试剂盒购自美国R&D Systems公司，Trizol Reagent购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒购自Takara公司，qPCR试剂SYBR Green Mix购自瑞士Roche公司。引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成。

二、方法

(一)小鼠饲养环境分组 3周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为SE组和EE组。SE笼大小为26 cm×16 cm×13 cm，每笼4只小鼠，每周更换新的笼子和垫料。EE笼大小为61 cm×43 cm×21 cm，每笼12只小鼠，并放置跑轮、管道、房屋、厕所、跷跷板等木制玩具，房屋处放少许棉花，厕所撒放浴沙，每半周更换玩具位置，每周更换新的笼子、玩具和垫料。环境温度维持为20±2℃，湿度维持为40%～60%，维持明暗周期为12 h(6∶00-18∶00)，小鼠自由饮水和进食。

(二)高架十字迷宫实验 高架十字迷宫(elevated plus maze, EPM)由高出地面50cm的一对开臂和一对闭臂组成，臂长30 cm，臂宽5 cm，闭臂两侧有20 cm高的不透明板封闭，四个臂呈十字交叉。实验开始前，将房间内的光照亮度调整为(20±2)lux。实验开始时将小鼠置于迷宫中央区域，头部朝向开放臂，释放后立即通过行为学系统分析SuperMaze软件记录小鼠在各个区域的持续时间及路程等参数，实验结束后将小鼠放回原饲养环境。每只小鼠测试后用含75%乙醇溶液的棉球清理小鼠排泄物并用干棉球擦干迷宫。

(三)肝纤维化模型的建立 48只C57BL/6小鼠随机分配在两组SE和两组EE，每组12只，在SE笼和EE笼中饲养3周后，每周两次腹腔注射10% CCl4橄榄油溶液5 μL/g(0.5 μL/g CCl4)，连续注射6周。为了更好的观察该发展过程中肝脏的急性损伤和修复阶段，分别在CCl4最后一次注射后1 d和5 d处死SE和EE小鼠，留取血清和肝脏组织备用。

(四)小鼠一般情况观察 包括建模过程中小鼠的精神状况、毛发泽度、活跃程度、每周体重和饲料摄入量的变化，并做好记录。

(五)血清学ALT检测 小鼠全血室温静置2 h，3 000 rpm，4℃离心15 min，取上清，按丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒说明书进行检测并计算。

(六)小鼠肝组织病理学检测 取小鼠肝组织标本用4%多聚甲醛固定后，梯度脱水、透明及透蜡后制作石蜡包埋块、5 μm切片并经HE染色和Sirius Red染色，中性树胶封片，在倒置显微镜下比较各组肝组织结构及纤维化程度并拍照。

(七)小鼠肝组织ELISA检测 肝脏组织自-80℃冰箱取出后，加入RIPA裂解液研磨充分，12 000 rpm，4℃离心10 min，上清稀释后经BCA法测定蛋白浓度，并按IL-22 ELISA试剂盒说明书检测并计算IL-22表达。

(八)小鼠肝组织RNA提取及RT-qPCR检测 肝脏组织自-80℃冰箱取出后，通过Trizol法提取总RNA并测定浓度，按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA，并利用SYBR Green体系进行实时定量PCR检测，IL-22RA1上游引物为5’-GACTA-TGGAGACCCGCAACC-3’，下游引物为5’-GCGGT-TTGATGGTAGTGTGC-3’；IL-10RA2上游引物为5’-CTTCTGGTGCCAGCTCTAGG-3’，下游引物为5’-GGAAAGCAGGTACCTCCCAC-3’；内参GADPH上游引物为5’-AAGATGGTGAAGGTCGGTGT-3’，下游引物为5’- GTTGATGGCAACAATGTC-CAC-3’。用仪器自带软件(AB7500)进行数据分析，计算2-△△Ct值。

三、统计学分析

结 果

一、 小鼠焦虑水平的检测、一般情况记录及肝脏损伤变化

有文献报道，EE能够减轻小鼠成年后的焦虑样行为[5]。为明确本研究中建立的小鼠EE模型是否成功，进一步采用EPM行为学实验检测SE和EE组小鼠的焦虑水平。结果显示，EE组小鼠在高架十字迷宫开放臂中的活动时间相对SE组升高1.46倍(P<0.05)(图1A和1B)，提示EE模型建立成功。随后将小鼠继续饲养于原环境中并开始注射CCl4诱导SE/EE下的肝纤维化动物模型。建模过程中，小鼠精神状况良好，毛发光泽无脱落，各组均无死亡情况，EE组较SE组小鼠更为活跃，动作敏捷，饮食摄入量增多。体重变化情况表明，CCl4注射前EE组体重较SE组减轻，而CCl4注射后期EE组体重较SE组明显增加，有统计学意义(P<0.05)(图1C)。对血清学ALT检测发现，小鼠在CCl4最后一次注射后1 d，肝脏有明显的急性损伤，EE组较SE组显著减轻，有统计学意义(P<0.001)(图1D)。

图1 A. 小鼠EPM示意图；B. SE和EE相对开臂时间比较；C. 小鼠体重变化趋势比较；D. 各组小鼠ALT水平比较

二、 各组小鼠肝脏组织病理形态变化

HE染色显示，SE组和EE组中均有不同程度的肝细胞肿大，胞质疏松化，并伴有炎细胞的浸润。CCl4最后一次注射后1 d，小鼠急性肝损伤较重，EE组肝细胞坏死面积小于SE组；注射后5 d，肝细胞再生修复，较注射后1 d坏死面积明显减少，EE组肝细胞排列紊乱程度比SE组较轻(图2)。

图2 各组小鼠肝脏HE染色(100)

同时，Sirius red染色结果显示，SE组可见明显肝脏纤维结缔组织增生，分割正常的肝脏组织，EE组明显减弱了胶原纤维的沉积(图3A)，通过对Sirius red面积定量进行比较发现，EE组较SE组显著减低了Sirius red的面积，具有统计学意义(最后一次注射后1 d，P<0.001；5 d，P<0.01)(图3B)。

三、各组小鼠肝内IL-22信号通路表达情况

对各组小鼠肝脏样本进行ELISA检测，CCl4最后一次注射后1 d结果表明EE组中IL-22表达与SE组相比明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01)(图4A)。IL-22RA1和IL-10RA2是IL-22的结合受体，经实时荧光PCR分析，CCl4最后一次注射后1 d结果表明EE组小鼠肝脏IL-22RA1和IL-10RA2较SE组均升高，差异均有统计学意义(IL-22RA1，P<0.05；IL-10RA2，P<0.01)(图4B)。CCl4最后一次注射后5 d，IL-22的表达水平以及受体IL-22RA1和IL-10RA2表达水平两组间无差异(P>0.05)(图4)。

讨 论

心理应激是能影响肝脏疾病发展的全身性因素之一，有研究明确，焦虑抑郁与慢性肝病有明显的相关性[4]，并且肝病死亡率随着心理压力评分的增加而显著增加[3]。目前，越来越多的研究运用动物模型进一步证实了心理应激对肝脏疾病的调控作用，但主要集中于恶性心理应激，如束缚应激[6]等，然而研究良性心理应激模型对临床肝病的诊疗具有更为积极的意义。EE作为一种调控神经可塑性的良性心理应激手段，不仅对中枢神经系统起到调控作用[7]，对于外周系统也起到全身性的调控作用[8]，本研究中我们首次将EE对机体的系统性调控作用扩展到肝脏病理过程的研究中，观察了EE诱导的良性心理应激对肝纤维化病理过程的影响。我们发现EE明显降低了小鼠的焦虑水平，减轻肝脏损伤，并显著降低了CCl4诱导的小鼠肝纤维化程度，该结果提示心理应激对肝脏病理过程具有重要的调控作用，同时我们也为生活方式与肝病相关性研究提供了有效的实验动物模型。

图3 A. 各组小鼠肝脏Sirius red染色(100)；B. Sirius red面积定量比较

图4 A. 各组肝脏组织IL-22 ELISA水平比较；B. 各组肝脏组织IL-22RA1、IL-10RA2水平比较

在机制研究中，我们发现在肝脏急性损伤阶段，EE显著上调了肝脏中IL-22水平，并促进了IL-22受体IL-22RA1和IL-10RA2的表达。IL-22是一种由免疫细胞分泌的具有特定的生物学活性并参与机体炎症性应答的特殊前炎症性细胞因子[9]，在研究刀豆蛋白A(ConA)诱导的急性肝损伤时，发现IL-22基因敲除小鼠对ConA诱导的肝损伤高度敏感，病理检查显示有更为广泛的炎症和损伤[10]。IL-22在CCl4诱导的肝纤维化模型中也发挥重要肝保护作用，有研究显示IL-22与其受体结合后，可通过激活STAT3-SOCS3-p53信号通路，诱导肝星状细胞衰老而减少肝纤维化[2]，同时IL-22也能直接减弱肝星状细胞的活化并下调促炎因子的表达而减轻肝纤维化[11]，我们的结果则提示，EE可能通过激活肝脏中IL-22信号，从而减轻CCl4引起的肝损伤和肝纤维化。然而IL-22在不同肝脏疾病中所发挥的作用存在较大差异，在肝癌中IL-22过度表达发挥了抗凋亡和促进肿瘤细胞增值、浸润的作用[12、13]，并且在二乙基亚硝胺(DEN)诱导的肝细胞癌模型中发现IL-22转基因小鼠对肝癌的易感性显著增加[14]。这提示IL-22的短期效应和长期效应可能是相反的，因此EE通过IL-22抑制肝纤维化的具体机制以及对于长期CCl4刺激诱导的肝硬化甚至肝癌的影响及机制仍需进一步研究。