骨桥蛋白和Ezrin蛋白在原发性肝癌组织中的表达及其与临床特征和预后的相关性

张洪川 张玉玺 段丛迪

原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤之一[1]。骨桥蛋白是一种带负电的非胶原性骨基质糖蛋白，广泛的分布于多种组织和细胞中[2-3]。骨桥蛋白被认为与肿瘤的发生具有一定的相关性[4]。Ezrin蛋白是细胞骨架与细胞膜之间的连接蛋白,参与了微绒毛的形成并与细胞形态的维持、运动、黏附及生存有关[5]。近年来骨桥蛋白和Ezrin蛋白在早期细胞免疫应答、肉芽肿炎症、肿瘤发生与转移的作用中倍受关注[6]。本研究探讨骨桥蛋白和Ezrin蛋白在原发性肝癌组织中的表达及其与临床特征和预后的相关性，旨在为原发性肝癌患者的治疗提供理论依据。

资料与方法

一、一般资料

将2013年1月至2016年12月于濮阳市油田总医院治疗的原发性肝癌手术切除标本46例作为研究对象(A组)，同时选取不典型增生肝组织标本46例(B组)以及正常肝组织标本46例(C组)。共选取138例存档石蜡包埋标本，年龄在27～76岁，平均年龄为(45.21±9.34)岁。纳入标准：所有患者均经手术切除治疗，术后病理学确诊为肝癌，患者临床资料齐全，具有术后随访资料；本研究经医院伦理委员会批准，所有患者及家属均知情同意并签署知情同意书。排除标准：(1)存在原发性肾功能障碍者；(2)存在其他系统组织器官恶性肿瘤者；(3)患者术前接受过放化疗治疗等。

二、研究方法

(一)免疫组化试剂 浓缩型属鼠抗人骨桥蛋白单克隆抗体购自美国Santa Cruz生物科技公司；鼠抗人Ezrin基因蛋白单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司；免疫试剂盒购自基因科技有限公司。所有操作方式均按照试剂盒说明执行。

(二)免疫组化SP法 按照1∶100稀释骨桥蛋白和Ezrin蛋白抗体，DAB显色，苏木素复染。一抗用PBS缓冲液代替作为空白对照。棕黄色信号表示阳性，定位于细胞与胞质中。

(三)原位杂交步骤 先在无RNA酶的环境中进行操作，用二甲苯组织切片进行脱蜡处理，再经过梯度乙醇水化，在37℃下蛋白酶消化30 min，在无水乙醇中脱水10 s，分别滴一滴探针溶液于各切片上，盖上盖玻片，保持37℃室温不变过夜。

(四) TBS浸泡步骤 先打开盖玻片，TBS洗片3次3 min。同时于37℃下滴2～3滴高辛抗体等待30 min。TBS浸泡3 min。DAB显色，苏木素复染。如果出现棕黄色颗粒信号表示杂交阳性，定位于细胞质，以TBS缓冲液代替探针作阴性对照，原发性肝癌中骨桥蛋白与Ezrin蛋白阳性于细胞核内表达，DAB显色，呈棕黄色颗粒，肝癌组织中蛋白质免疫组化染色位于细胞膜与细胞质内，呈棕黄色。参照染色强度和阳性表达细胞数来确定判定结果。

三、术后随访

随访方式采用电话、上门、门诊或住院等方式进行，记录肝癌患者术后复发、转移以及死亡情况。

四、统计方法

结 果

一、骨桥蛋白在三组标本中的表达情况比较

A组患者骨桥蛋白阳性率为76.09%(35例)、Ezrin蛋白阳性表达率为73.91%(34例)明显高于B组的39.13%(18例)、50.00%(23例)与C组的19.57%(9例)、21.74%(10例)(P<0.05)，B组患者骨桥蛋白和Ezrin蛋白阳性表达率高于C组(P<0.05)。

二、骨桥蛋白和Ezrin蛋白在肝癌组织中的表达与临床病理特征的关系

骨桥蛋白和Ezrin蛋白表达水平与患者性别、年龄、HBsAg的阳性表达、有无肝硬化、肿瘤大小、肿瘤分化程度、AFP水平、肿瘤数目、TNM分期等临床病理特征无明显相关性(P>0.05)，而在发生转移与癌组织累及肝被膜患者中骨桥蛋白的阳性表达率明显高于未发生转移与未累及肝被膜患者(P<0.05)，且肿瘤越大 Ezrin蛋白在癌组织中的阳性表达率越高(P<0.05)。见表1。

表1 骨桥蛋白与临床特征的关系(例，%)

注：与无转移比较，aP<0.05，与未累及肝被膜比较，bP<0.05，与肿瘤≤5 cm比较，cP<0.05

三、骨桥蛋白与患者预后状况相关性分析

骨桥蛋白在阳性患者中位生存时间为32.10个月，阴性患者平均生存时间为37.10个月，差异具有统计学意义(P<0.05)。

四、Ezrin蛋白与患者预后状况相关性分析

Ezrin蛋白在阳性患者中位生存时间为30.10个月，阴性患者平均生存时间为38.10个月，差异具有统计学意义(P<0.05)。

讨 论

骨桥蛋白是目前临床上新提出的一种监测肝癌转移与复发的指标[7]。白治苗等[8-9]研究了骨桥蛋白在子宫内膜异位中的表达情况，结果证实骨桥蛋白在子宫内膜异位症中具有较高表达水平，并且是诱导子宫内膜异位症发生的关键，为子宫内膜异位症的治疗提供了一种新的治疗思路。胡雪等[10]研究证实，骨桥蛋白也参与胃癌的发病，可较好预测胃癌的生长/浸润以及转移过程所发生的基因以及分子变化。本研究结果显示，骨桥蛋白在肝癌组织中的阳性表达率明显高于正常组织与不典型增生患者，提示骨桥蛋白在肝癌的预测中具有一定作用，并且参与肝癌的转移，这与以上研究结果相似。且骨桥蛋白阳性表达率越高越影响肝癌患者的预后，这与李颖利[11]、李欣遥等[12]学者的研究结果相似。本研究结果证实，肝癌患者可通过检测骨桥蛋白的表达情况来判断肿瘤转移、复发以及预后情况。

Ezrin蛋白是一种细胞骨架连接蛋白，其对调节细胞活动，如生存、黏附、迁移等具有重要作用[13]。本研究结果显示，Ezrin蛋白在肝癌组织中表达率明显上升，并且在术后的随访中发现，患者的生存时间与Ezrin蛋白的表达情况有密切相关性，这与黄涛等[16]研究结果一致。证实了Ezrin蛋白在肝癌的发生、发展具有重要意义，对肝癌的治疗起到一定的指导意义。