基于SIRT3/FXO1信号通路探讨大黄素对NASH大鼠肝细胞损伤和肝组织炎症的影响

寇小妮 解新科 郝明霞 吴维 边倩 马文军

NAD依赖性脱乙酰酶(Sirtuin 3，SIRT3)是一种NAD +依赖性蛋白质脱乙酰基酶，可通过调节多种蛋白质的乙酰化水平来调节氧化代谢和氧化应激。研究表明，长期高脂肪饮食可导致线粒体基质中SIRT3表达减少和高乙酰化蛋白[1]。FOXO1是SIRT3调控下的重要代谢调控因子，研究表明，芳香烃受体的激活可降低SIRT3的活性，导致小鼠对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的易感性增加[2]。大黄素为蓼科植物虎杖干燥根茎和根的提取物，具有良好的抗炎、抗氧化、调节代谢作用[3]。本研究拟基于SIRT3FXO1信号通路探讨大黄素对NASH大鼠细胞损伤和肝组织炎症的影响。为NASH的治疗提供理论及临床依据。

材料与方法

一、动物分组

Sprague-Dawley大鼠100只，6～8周龄，体质量(200±20)g购自北京维塔尔河实验动物有限公司(北京)。根据体重随机分成5组：对照组、模型组、大黄素低、中、高剂量组(10、20、40 mg/kg)，每组20只，雌雄各半。

二、药物、仪器及试剂

大黄素购自美伦生物科技有限公司。 将大黄素溶解在10% DMSO中，大鼠用药量为成人的20.13 倍，以10 mL/kg灌胃，将药液浓度配制成为10 g/mL。SIRT3、FXO1、AST、ALT、TNF-α、IL-6、CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9 ELISA试剂盒购于南京森贝伽生物科技有限公司，抗SIRT3(Bioss)、抗FXO1(Santa Cruz;达拉斯，TX)、DAB显色试剂盒购于博士德生物工程有限公司，HematoxylinEosin Stain试剂盒(南京建城生物工程研究所)，SABC-AP试剂盒(建国生物工程研究所，南京)。

三、各实验组的制备

对照组大鼠采用普通动物饲料喂养，模型组和大黄素剂量组采用高脂(普通标准饲料82%、猪油 10%、胆固醇2%、3号胆盐1%、蛋黄粉5%)饮食喂养。第12周每组处死两只大鼠以验证模型。从第13周开始，大黄素剂量大鼠每天给予10、20、40 mg/kg的大黄素灌胃，而模型组和对照组给予同等体积的蒸馏水灌胃。12周后，处死大鼠，取出肝脏以计算肝脏指数(肝脏湿重/体重≤100%)。

四、大鼠肝细胞损伤指标的测定及肝组织病理结构观察

根据Brunt标准评估肝脏脂肪变性，炎症反应和球状样变化及NASH活动度积分(NAS)等病理组织学变化进行诊断。制作常规HE切片，将切片用柠檬酸铅和乙酸铀酰染色10 min，并在透射电子显微镜下观察。在相同的放大倍数下，随机选择并观察每组中的三个样品。

五、大鼠肝组织AST、ALT、TNF-α、IL-6水平的检测

无菌条件操作制作肝匀浆。ELISA测定组织液中AST、ALT、TNF-α、IL-6的水平。

六、大鼠肝脏中SIRT3、FXO1 mRNA水平的测定

RNATrizol Kit(Sangon Biotech，上海)从 50 mg肝脏组织样品中分离总RNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的的完整性。并通过QuantiTect○R反转录试剂盒(QIAGEN GmbH; Hilden，Germany)产生cDNA。 cDNA的扩增通过QuaniNovaTMSYBR○RGreenPCR试剂盒(QIAGEN)在ABI 7 500上进行。将SIRT3、FXO1 mRNA的表达水平归一化为GAPDH mRNA后，通过2-ΔΔCt法计算相对RNA表达。

七、SIRT3、FXO1蛋白水平测定

通过免疫组化法检测SIRT3、FXO1在肝脏组织中的表达。在400放大倍数下，随机选择五个不同的显微镜视野。以高放大倍数观察500个细胞。在至少五个视野中使用半定量方法对染色的组织切片进行评分。

八、大鼠肝脏中CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9蛋白水平测定ELISA法测定组织液中CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9的水平。

九、统计学方法

结 果

一、大黄素对肝细胞损伤指标的影响

与对照组比较，大黄素各剂量组脂肪变积分、炎症坏死灶积分、气球样变积分、NAS 积分升高(P<0.05)；与模型组比较，大黄素各剂量组脂肪变积分、炎症坏死灶积分、气球样变积分、NAS 积分降低，且随着大黄素给药剂量的增加，脂肪变积分、炎症坏死灶积分、气球样变积分、NAS 积分逐渐降低，剂量-效应关系明显(P<0.05)。见表1。

二、大黄素对大鼠肝组织炎症指标的影响

与对照组比较，大黄素各剂量组AST、ALT、TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)；与模型组比较，大黄素各剂量组AST、ALT、TNF-α、IL-6水平降低，且随着大黄素给药剂量的增加，AST、ALT、TNF-α、IL-6水平逐渐降低，剂量-效应关系明显(P<0.05)。见表2。

三、 大黄素对各组大鼠肝脏结构的影响

图1可见，对照组肝脏细胞细胞完整，单层索状排列围绕中央静脉放射状分布，结构正常，染色清晰，核呈卵圆形位于中央胶，在肝脏细胞间质及血管周围见少量亮绿色胶原纤维。模型组可见大量脂肪变性及坏死肝脏细胞，排列紊乱，且细胞脱失现象明显，细胞核固缩，肝脏纤维化明显，间质内大量炎性细胞浸润，胶原纤维明显增加。大黄素高剂量组几乎无脂肪变性，见少量坏死肝脏细胞，绿色胶原纤维较模型组而言明显减少；大黄素中、低剂量组较模型组而言，坏死肝脏细胞减少，仍可见脂肪变性，但绿色胶原纤维依然明显存在，具有明显的剂量依赖效应。

四、大黄素对大鼠肝脏组织SIRT3、FXO1 mRNA及其蛋白表达水平的影响

与对照组比较，大黄素各剂量肝脏组织SIRT3、FXO1 mRNA表达水平降低(P<0.05)；与模型组比较，大黄素各剂量肝脏组织SIRT3、FXO1 mRNA表达水平升高，且随着大黄素组给药剂量的增加，肝脏组织SIRT3、FXO1 mRNA表达水平逐渐升高，剂量-效应关系明显(P<0.05)。

与对照组比较，大黄素各剂量肝脏组织SIRT3、FXO1 蛋白表达水平降低(P<0.05)；与模型组比较，大黄素各剂量肝脏组织SIRT3、FXO1 蛋白表达水平升高，且随着大黄素组给药剂量的增加，肝脏组织SIRT3、FXO1 蛋白表达水平逐渐升高，剂量-效应关系明显(P<0.05)。免疫组化结果显示，SIRT3、FXO1阳性表达为棕褐色，各组SIRT3、FXO1阳性表达情况与各蛋白表达水平符合。见表3，图2、3。

表1 大黄素对肝细胞损伤指标的影响(分，±s)

表2 大黄素对大鼠肝组织炎症指标的影响(±s)

图1 大黄素对各组大鼠肝脏细胞结构的影响(HE. 400) A: 对照组;B: 模型组;C-E: 大黄素组低、中、高剂量组

六、大黄素对各组大鼠肝脏组织凋亡因子水平的影响

与对照组比较，大黄素各剂量肝脏组织CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9表达水平升高(P<0.05)；与模型组比较，大黄素各剂量肝脏组织CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9表达水平降低，且随着大黄素组给药剂量的增加，肝脏组织CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9表达水平逐渐降低，剂量-效应关系明显(P<0.05)。见表4。

讨 论

大黄是传统中草药，广泛用于治疗胰腺炎、胆囊炎、急性腹腔综合征和其他炎症性疾病[4]。大黄素是大黄的一种蒽醌元素(树脂6-甲基-1,3,8-三羟基蒽醌)，具有抗炎、抗氧化作用。研究发现，大黄素可改善大鼠肠系膜微循环障碍，能降低炎症因子的表达，保护重症急性胰腺炎的肠功能，其机制可能是通过抑制NF-κB活化和黏附分子的表达[5-6]。本研究结果显示，与模型组比较，大黄素各剂量组脂肪变积分、炎症坏死灶积分、气球样变积分、NAS 积分、AST、ALT、TNF-α、IL-6水平降低。病理结果显示，大黄素高剂量组几乎无脂肪变性，见少量坏死肝脏细胞，绿色胶原纤维较模型组明显减少；大黄素中、低剂量组与模型组比较，坏死肝脏细胞减少，仍可见脂肪变性，但绿色胶原纤维依然明显存在，具有明显的剂量依赖效应。说明大黄素能降低肝脏细胞炎性反应进而减轻NASH大鼠肝细胞损伤程度。

表3 大黄素对各组大鼠肝脏组织SIRT3、FXO1 mRNA及其蛋白表达水平的影响(±s)

图2 大黄素对各组大鼠肝脏组织SIRT3蛋白表达水平的影响(免疫组化，400) A: 对照组;B: 模型组;C-E: 大黄素组低、中、高剂量组

图3 大黄素对各组大鼠肝脏组织FXO1蛋白表达水平的影响(免疫组化，400) A: 对照组;B: 模型组;C-E: 大黄素组低、中、高剂量组

组别鼠数CASPASE-3CASPASE-6CASPASE-9对照组20139.46±5.57145.77±6.4647.13±15.95模型组20179.75±7.37267.86±6.98187.66±9.47大黄素组 10 mg/kg20169.35±8.88239.45±6.98134.14±12.74 20 mg/kg20146.31±12.76180.15±10.6963.23±10.73 40 mg/kg20142.81±9.60 119.63±12.7357.45±8.76

SIRT3是哺乳动物sirtuin蛋白家族的成员，是酵母Sir2蛋白的同源物，具有NADP依赖的脱乙酰酶活性，可通过组蛋白和非组蛋白的乙酰化调节各种蛋白质的功能。FOXO1通过胰岛素信号传导调节糖异生和糖原分解，是一种起重要作用的转录因子，其决定前脂肪细胞致力于脂肪形成。FOXO1的活性受乙酰化和磷酸化双转化后的修饰方式调节。 FOXO1与DNA的结合能力通过乙酰化/去乙酰化调节。研究表明，人二倍体成纤维细胞中FOXO1的乙酰化水平受SIRT3调节，使FOXO1脱乙酰化，增加活性，并刺激抗氧化基因如过氧化氢酶和SOD的表达，进而减少超氧阴离子自由基、ROS水平。SIRT3也可以直接脱去乙酰型SOD并增强其活性。SIRT3/FOXO1/SOD信号通路在增强氧化应激耐受和减少氧化应激损伤中起重要作用。大黄素可以调节sirtuins家族成员的表达[7-8]。此外，大黄素可通过核因子k基因结合、线粒体融合蛋白二、氧化应激、高迁移率族蛋白-等信号通路发挥肝脏保护作用。而氧化应激是NASH发生和发展的关键因素[9-10]。本研究结果显示，与模型组比较，大黄素各剂量组SIRT3、FXO1 mRNA、蛋白表达水平升高，且随着大黄素剂量的增加，肝脏组织SIRT3、FXO1 mRNA、蛋白表达水平逐渐升高，剂量-效应关系明显。与上述结论符合，同时也提示，大黄素能促进SIRT3、FXO1mRNA、蛋白的表达降低肝脏细胞炎性反应，进而减轻NASH大鼠肝细胞损伤程度。本研究同时发现，大黄素能降低凋亡因子CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9的表达；而CASPASE-3、CASPASE-6、CASPASE-9也是FXO1调控下的细胞因子。说明大黄素可能降低肝细胞凋亡进而减轻NASH对肝细胞的损伤。

综上所述，大黄素能促进SIRT3、FXO1 mRNA、蛋白的表达降低肝脏细胞炎性反应，减少肝细胞凋亡进而减轻NASH大鼠肝细胞损伤程度。