白酒大曲风味物质研究进展

周晨曦，郑福平*，李贺贺，吴继红，黄明泉，孙宝国

（1.北京工商大学 食品学院 北京市食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100048；2.北京工商大学 食品学院 食品质量与安全北京实验室，北京 100048）

白酒是世界上最古老的蒸馏酒之一。2017年，国内白酒累计完成销售收入5 654.42亿元，与上年同期相比增长了14.42%，酿酒总产量达到1 198.06万kL，可谓是中国的国民酒。俗话说“水是酒的血，曲是酒的骨，粮是酒的肉”、“有美酒必备佳曲”。曲是酿酒所用的糖化发酵剂，其质量决定了白酒的产量和质量[1]。按照制曲工艺，白酒酒曲可分为三类：大曲、小曲和麸曲[2]。大曲是以小麦为主要原料、经粉碎后加水压制、在人工控温条件下培育而成的曲块，含有多种菌类及酶类物质，因其相对于小曲形状较大，又称为块曲[2-3]。由于富含各类微生物，在制曲和酿造过程中，这些微生物的生长和繁殖产生了大量的代谢物，进一步赋予各种大曲酒独特的风格与特色，这是其他酒曲所不能比拟的[4]，因此，我国的名优酒大都采用大曲酿造。茅台酒、泸州老窖和汾酒作为3种最著名的典型白酒风味代表（酱香型、浓香型和清香型），均使用大曲作为糖化发酵剂。

本文简介了白酒大曲的制作工艺及分类，总结了大曲风味物质研究现状，包括前处理方法、定性定量方法和已检出风味物质的研究进展，为研究大曲风味物质提供参考。

1 大曲的制作工艺与分类

大曲的培养具有生料制曲、自然网罗微生物、季节性强、堆积培养和培养周期长的特点[4]。因其香型、曲块不同，制作工艺也有区别，但一般分为五步：选配原料、粉碎拌料、压制成型、入室培养和贮曲保存[4-7]。

按照制曲过程中的最高品温，大曲一般分为三类：高温曲、中温曲和低温曲。高温曲制曲时最高品温高于60℃，一般用于生产酱香型白酒，以茅台酒为代表，也有部分芝麻香型和兼香型白酒使用高温曲；中温曲制曲时最高品温控制在50～60℃，一般用于酿造浓香型白酒，部分凤香型、老白干香型和特香型白酒也采用中温曲，但原料配比、制作工艺各有差异；低温曲制曲时最高品温低于50℃，一般用于酿制清香型白酒，以汾酒为典型。也有将不同大曲混合使用的，如景芝白干酒大曲以纯小麦为原料，或小麦、大麦和豌豆混合制曲，将中温曲（最高品温50～55℃）与高温曲（最高品温高于65℃）混合使用；扳倒井酒大曲以小麦为原料，将高温曲（最高品温高于65℃）与多种微生物培养麸曲联合使用[8]；馥郁香型酒鬼酒则将大曲与小曲结合使用，使用的大曲以纯小麦为原料，制曲最高品温达57～62℃。各名优酒厂传统制曲原料配比和最高品温总结见表1。

表1 各名优酒厂传统制曲原料配比及最高品温总结Table 1 Summary of the ratio of traditional Daqu-making materials and the maximum incubation temperatures of various famous Baijiu

2 大曲研究现状

大曲中含有多种微生物菌系和各种酿酒酶系。从Web of Science数据库中检索有关“大曲”和“白酒”的研究论文，截止2018年11月总共发文量为246篇，出现频率较高的词如微生物和菌株均为微生物研究方面，即目前关于大曲的大部分研究主要集中在微生物群落结构研究[10]和功能微生物研究上[11-12]。LIU J J等[13]研究发现，同种的水解酶与不同大曲中的代谢产物相关性不一致，如淀粉酶在清、浓香型大曲中与糖代谢物呈正相关，而在酱香型大曲中与糖代谢和蛋白质代谢相关。

大曲除了是大曲酒酿造中的糖化发酵剂以外，也是生香剂。在制曲过程中，原料的分解产物和微生物的代谢产物，直接或间接地构成了白酒的风味物质。WANG W Y等[14]从茅台大曲中分离出了一株枯草芽孢杆菌，并认为在经过多轮微生物发酵后，通过美拉德反应将孢子的重要组分2,6-吡啶二羧酸（或其衍生物）转化为各吡啶类化合物——茅台酒的特征香物质。糠味是白酒中的杂味之一，尤其是清香型白酒中的主要杂味，而这一杂味的源头为呈土味、霉味的土味素。DU H等[11，15]对不同成熟阶段的大曲（老白干、汾酒）进行了研究，结果表明，土味素的主要来源可能是大曲中链霉菌代谢产生。

同时，大曲的质量直接决定了基酒的质量，对于大曲质量的判断、鉴别除了理化检测外，感官鉴评也尤其重要。感官鉴评主要通过外观和闻香判定，闻香即对大曲中的挥发性香气成分所表现的综合香气进行感官评价[16]。因此，研究大曲中丰富的香气成分不仅有助于研究白酒的香气成分，还有助于对大曲质量的判别。

有关大曲风味物质的研究最早可追溯到2006年，赵东等[17]首次利用顶空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析了五粮液酿造用的一级、二级和三级大曲的挥发性成分，共对68种挥发性和半挥发性成分进行了定性，发现大曲中的许多微量香气成分如己酸、己酸乙酯和乙酸乙酯等与基础酒中的香气成分相似。范文来等[18]利用HS-SPME和GC-MS分析了某酱香型大曲中的挥发性成分，共检测到112种挥发性成分，包括酸类、硫化物、呋喃类化合物、醛类、酯类、酮类、醇类、芳香族和吡嗪类等多种化合物，其中，含量最高的是酸类和吡嗪类化合物，单个化合物含量最高的是异戊酸。张春林等[19]利用HS-SPME和GC-MS分析检测了泸州老窖大曲中的挥发性成分，主要为醇类、吡嗪类、酯类、酮类和醛类，其中单个化合物的含量最高的化合物是2-戊醇。LE V D等[20]利用HS-SPME与GC-MS研究了汾酒大曲七个温曲过程（卧曲、上霉、晾霉、潮火、大火、后火和养曲）中挥发性化合物的变化，共鉴定出83种主要挥发性化合物，并结合主成分分析（principal component analysis，PCA），发现造成温曲不同阶段风味差异的化合物主要是己醛和（E）-2-辛烯醛等。胡沂淮等[21]利用索氏提取法结合GC-MS对洋河大曲进行了分析检测，共检测出39种挥发性成分，以有机酸类最多，其次是含氮化合物。发现大曲中所含有的挥发性成分主要是白酒中香气成分的前体物质。如异戊醇、1,2-丙二醇、正戊酸、正丁酸等既是风味前体物质又是成品酒的风味物质，四甲基吡嗪、乙醛缩二乙醇和丁内酯等是成品酒的风味物质，N,N-二甲基乙酰胺和1H-吡咯-2-甲醛等是风味前体物质，这些物质经发酵、蒸馏等工艺后消失。邢钢等[22]应用HS-SPME结合GC-MS对泸州老窖大曲制曲过程中挥发性成分进行了动态分析。共检测到54种挥发性成分，其中醇类最多。动态分析结果表明，大部分挥发性成分（醇类、酯类、醛类、酮类、酸类、酚类和芳香族化合物）含量呈现先增后减的趋势，在8 d时达到最大值，随后下降，到贮存后期含量趋于稳定；大部分含氮化合物在发酵前期均没有检测到，发酵后期含量逐渐增加，随着贮存时间增长含量又逐渐减少。陈美竹[16]利用HS-SPME和GC-MS分析检测了3种酱香型高温大曲（生产用曲、出仓黄曲和出仓白曲）的挥发性成分，共定性了40种化合物，包括12种杂环类化合物，其中以吡嗪类最多。孟维一等[23]利用HS-SPME和气相色谱-嗅闻-质谱（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS）研究了两个芝麻香型酒厂生产的高、中、低温大曲，共检出69种挥发性化合物，棕榈酸甲酯在所有大曲样品中都有检出，且含量都相对较高。嗅闻结果显示，共有17种香气活性化合物可被至少两个嗅闻人员闻到，2-乙基-3,5-二甲基吡嗪的香气活性（odor activity value，OAV）值最高。李登勇等[24]以来源于不同生产地、企业和陈曲时间的酱香型大曲为研究对象，利用HS-SPME和GC-MS研究了其挥发性组分特征。共检出113种挥发性化合物，其中50种物质在所有样品中均检出，2,5-二甲基-3-丁基吡嗪、三甲基吡嗪和苯乙醇等11种挥发性物质含量丰度较高。统计分析结果表明，较高的吡嗪类物质是茅台原产曲的重要特征，而源于其他生产域的酱香型大曲中挥发性组分则以酯类为主。马茹菲等[25]利用SPME-GC-MS研究了不同产地的清香型大曲，共检出78种挥发性组分，其中醇类、酯类含量较高，挥发性成分丰富的样品其感官评价也有较为浓郁的曲香。

3 大曲风味物质的分析检测方法

有关大曲风味物质预处理方法和定性定量方法总结可见表2。

表2 有关大曲风味物质研究预处理方法和定性定量方法总结Table 2 Summary of pretreatment methods,qualitative and quantitative methods of Daqu flavor compounds analysis

续表

3.1 大曲样品前处理方法

大曲是固体状态，提取香气成分的难度比液体状态的白酒更大。要从固体粉末中提取香气成分，主要有两种方法：①直接从样品的顶空气体中提取，如HS-SPME等；②将固体样品转换为液体样品，再使用处理液体样品的方法进行提取，如液液萃取-溶剂辅助风味蒸发（liquid-liquid extraction-solvent assisted flavor evaporation，LLE-SAFE）、同时蒸馏提取（simultaneous distillation-extraction，SDE）等。

3.1.1 固相微萃取法

大部分研究人员均采用HS-SPME来对大曲进行预处理。HS-SPME是集采样、萃取、浓缩和进样于一体的无溶剂样品微萃取技术，操作简单，携带方便，操作费用低，绿色环保。ZHENG J等[9]以不同温曲阶段的五粮液包包曲为研究对象，利用HS-SPME和GC-MS、气相色谱-火焰离子化检测器（gas chromatography flame ionization detector，GC-FID）研究了主要挥发性化合物，结果显示，当温度升高时，挥发物总含量也增加，在3 d达到最高水平，之后降低，且升温阶段是乙酸和乳酸的产生阶段，降温阶段是吡嗪产生阶段。3-甲基丁酸乙酯、（E,E）-2,4-己二烯醛、（E,E）-2,4-壬二烯醛、乙酸和丁酸的OAV值较大。

然而，萃取头的种类、样品用量、萃取剂的选择、萃取时间和萃取温度等萃取条件都会影响SPME的萃取效果，针对以上影响因素，研究人员对萃取条件进行了优化。范文来等[18]以某酱香型大曲为对象，研究了样品萃取量、超声波萃取时间以及不同萃取溶剂对萃取效果的影响。张春林等[19，35]以泸州老窖大曲为对象，分别考察了萃取头、萃取时间、萃取温度、样品用量及萃取方式对萃取效果的影响。郭兆阳等[41]以某清香型大曲为对象，对萃取头、溶剂、样品用量、萃取温度、萃取时间和盐离子浓度进行了优化。陈美竹[16]以茅台大曲为研究对象，考察了萃取方式、萃取温度和萃取时间对萃取效果的影响。孟维一等[23]以芝麻香型白酒大曲为研究对象，对萃取头、萃取时间、萃取温度和样品量进行了优化，其优化结果总结见表3。

表3 HS-SPME提取大曲风味物质效果优化总结Table 3 Summary of the extraction results optimization of Daqu flavor compounds by HS-SPME

3.1.2 溶剂萃取法

溶剂萃取法是风味分析中的经典方法。其操作简单，回收率高，但样品使用量大，萃取液在浓缩过程中会损失一部分低沸点的挥发性成分，且有机溶剂毒性严重危害人体健康。同时，大曲中富含油脂、色素、蛋白质以及糖类，这些不挥发性物质严重影响气相色谱对挥发性风味化合物的检测。吕云怀等[39]通过浸提、液液萃取和GC-MS分析了浓、酱、清香三种大曲，共定性了103种挥发性化合物。酱香大曲的风味物质最为复杂，离子丰度也最高，浓香大曲和清香大曲二者相差不是十分明显。汪玲玲[34]则以5种不同香型的大曲（酱香、浓香、清香、豉香和药香）和市售梁山大曲为研究对象，利用液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）处理样品进行气相色谱-嗅闻仪联用（gas chromatographyolfactometry，GC-O）分析，HS-SPME和GC-MS对香气物质进行定性定量，结合聚类分析（cluster analysis，CA）和判别分析（discriminant analysis，DA）对样品成功进行区分。

3.1.3 溶剂辅助风味蒸发法

溶剂辅助风味蒸发法（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）是一种从复杂食品基质中全面、温和地分离香气化合物的方法，1999年由ENGEL W等[45]发明。SAFE系统是由蒸馏装置和高真空泵的紧凑结合，样品中的热敏性挥发性成分损失少，萃取物具有样品原有的自然风味。这是国际上较为流行的方法，目前已应用在黄酒酒曲[46]、黑麦面包[47]、可可粉[48]、脱脂奶粉[49]和谷物咖啡渣[50]等香气物质的提取上。ZHENG J等[9]利用LLE-SAFE和GC-O-MS研究了五粮液“包包曲”在温曲过程中香气成分的变化，共鉴定出54种香气活性成分。

3.2 大曲风味物质定性定量方法

目前广泛应用于风味物质定性分析的方法主要有标准品比对法、保留指数（retention index，RI）法、GC-MS和GC-O等。但大部分关于大曲风味物质的研究，所采用方法均为MS分析进行谱库对比，且只采用单一色谱柱进行分离，无法对所有化合物进行分离和准确定性，如共流出组分和具有相似质谱图的同分异构体。在其他样品的风味化学分析过程中，化合物的定性常采用多种方法相结合：首先采用MS进行谱库对比初步定性、再通过计算组分在不同极性色谱柱上的保留指数与标准品的进行对比，同时结合闻香中的香气特征等多种定性方式准确确定该化合物结构[51]。

ZHANG C L等[52]利用HS-SPME和GC-MS分析研究了由泸州老窖生产的高温曲和中温曲，实验数据与Wiley谱库和美国国家标准技术研究所（nationalinstituteof standardsand technology，NIST）谱库相匹配，取当正反匹配度均＞800的鉴定结果；并计算化合物的保留指数（retention index，RI）；部分利用标准化合物进行定性。共鉴定了75种挥发性化合物，其中含量最大的一组是含氮化合物，如2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪，其次是醇类。

广泛应用于食品风味物质定量分析的方法主要有面积百分比定量法、峰高百分比法、归一化法、外标定量法和内标定量法等。如表2所示，目前关于大曲的定量分析大部分使用的还是单一内标进行半定量，定量结果不够准确，数据缺乏说服力。近年来，也有采用多种内标对标准曲线进行校正来定量的。ZHENG J等[9]利用内标标准曲线法对五粮液包包曲中的50种风味成分进行了定量分析，同时，采用苄酯衍生化法[53]定量了乙酸、丙酸、丁酸和乳酸四种有机酸。

4 大曲中已检测到的风味物质

据笔者统计，截至2018年12月，在大曲中已检测到456种风味物质（见表4）。按照化合物类别进行分类，其中酯类最多，达到94种，其次为醇类（62种）、醛类（43种）、酸类（41种）、吡嗪类（36种）、酮类（34种）、脂肪烃（25种）、其他杂环类（25种）、呋喃类（18种）、含氮类（16种）、酚类（14种）、醚类（11种）、含硫类（10种）、芳香烃（9种）、萜烯类（8种）、内酯类（7种）和缩羰基类（3种）。466种风味物质中定量了336种，其中250种只采用内标法或归一化法进行定量。从大曲类型来看，高温曲中已检测到255种风味物质，其中定量分析了225种；中温曲中已定性分析了328种风味物质，其中定量分析了237种；低温曲中已检测到140种风味物质，其中120种已被定量分析。

表4 大曲中已检测到的风味物质总结Table 4 Summary of Daqu flavor compounds detected in Daqu

续表

5 展望

曲香是酒香的重要香气来源，相比于白酒风味成分研究上取得的巨大进展，有关酒曲的研究多还仅仅停留在微生物分析上，对酒曲风味成分的研究仍在初步阶段。目前大部分研究都只通过MS谱库检索进行化合物定性、内标法进行半定量分析，定性、定量方法不够准确，尤其是部分非挥发风味物质的存在可靠性存疑，很多风味物质的位置异构体、顺反异构体和光学异构体的结构仍需进一步确认。另外，缺少对风味物质香气活性的研究，哪些物质对曲香具有重要贡献尚不清楚；如脂肪族烃、芳香烃等通常气味较弱，对大曲风味贡献不大。各个厂家、不同陈曲时间生产的大曲有何区别，哪些物质导致了这些差异，目前尚未被科学、系统地认知。建议在今后研究中，借鉴分子感官科学研究方法，用GC-O分析白酒大曲挥发性成分，结合芳香萃取物稀释分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）等方法确定大曲中主要香气活性成分；采用双柱保留指数比对、标准品对比等手段进行准确定性；采用外标标准曲线法、内标标准曲线法或稳定同位素稀释法（stable isotope dilution assay，SIDA）等方法进行风味物质准确定量。这将有利于深入了解大曲风味的组成及其对白酒香气的贡献，为提高大曲质量、改善成酒品质提供数据支撑。