2-甲氧基雌二醇对缺血缺氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响

刘红军 杨杰

急性心肌梗死治疗的关键在于尽早溶栓恢复心肌血流灌注[1]，但多项研究发现[2-3]，在心肌恢复血流灌注时，心脏功能非但没有恢复，心肌损伤反而加重，心肌坏死面积增加。2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2ME2）作为雌二醇代谢产物，存在于尿液和血液中，其具有抗肿瘤活性，在抑制肿瘤细胞增殖及微血管生成中发挥重要作用[4]。有研究指出[5-6]，2ME2可抑制缺氧诱导因子-1α（HIP-1α）表达及凋亡相关基因Caspase-3表达而在减轻局灶性脑缺血鼠神经细胞凋亡中发挥重要作用。本研究通过构建大鼠急性心肌梗死模型，观察2ME2对心脏功能及心肌细胞凋亡的影响。

材料与方法

1.实验动物 清洁级健康，雄性，成年SD大鼠40只，7～8周龄，体质量（260±20）g，购自河南省实验动物中心（合格证号：SYXK（豫）2016-0002），饲养于标准环境下，自由进食、进水，适应性饲养7 d。利用随机数字表随机分为假手术组、模型组、溶媒组和2ME两组，每组10只。

2.主要试剂和设备 2ME2和二甲基亚砜由美国Sigma公司提供，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自上海研卉生物科技有限公司，兔抗鼠HIP-1α多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗鼠Bcl2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3（Bcl2/adenovirus E1B 19kDa-interacting protein 3，BNIP3）多克隆抗体购自武汉艾美捷科技有限公司，小动物呼吸机购自上海千盛生物科技有限公司，彩色多普勒超声显像仪购自德国Siemens公司，凝胶电泳成像分析系统购自美国Bio-Rad公司。

3.构建大鼠急性心肌梗死模型 参照文献[7]中的方法制备大鼠急性心肌梗死模型：腹腔注射4%水合氯醛将大鼠麻醉，备皮、固定于小动物手术台，行气管切开、插管，用小动物呼吸机辅助呼吸，潮气量18 mg/kg，呼吸频率70次/min，用手术刀沿胸骨左缘2、3、4肋间纵向切开，钝性分离胸膜，打开心包膜，使心脏充分暴露。用6-0医用缝合线穿过左冠状动脉前降支起始部心肌浅表层，进针深度约1 mm，丝线两端穿长2 cm的套线圈，同时拉紧两端丝线使套线圈垂直压向心脏，将左冠状动脉前降支血流阻断，制造心肌缺血，以心电图示ST段抬高为模型构建成功。30 min后，将套线圈松开，使心肌血流恢复，灌流120 min。假手术组仅使心脏暴露而不结扎左冠状动脉前降支。建模过程中，模型组和溶媒组各死亡1只大鼠，均进行了补充，保持样本量不变。2ME两组在大鼠苏醒3 h内按24 mg/kg剂量腹腔注射2ME2，溶媒组和模型组则给予等量的二甲基亚砜或0.9%氯化钠溶液，1次/d，连续7 d。

4.各组大鼠心脏功能检测 建模后第8天时，腹腔注射4%水合氯醛，待大鼠麻醉后，仰卧位固定，备皮，用彩色多普勒超声显像仪分别对大鼠LVEDD和LVESD测量，计算LVEF及短轴收缩率（FS），连续测量3个心动周期取均值。

5.各组大鼠心脏梗死区心肌细胞凋亡情况检测 于各组大鼠心脏功能检测完毕后，各组大鼠处死，取心脏，留取梗死区组织，10%甲醛固定，石蜡包埋，按0.4μm厚切片，脱蜡至水，利用0.1%Triton X-100及0.1%柠檬酸钠液通透，PBS冲洗3次，血清封闭25 min，PBS冲洗3次，按TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明避光孵育60 min，甘油封片，显微镜下观察，以细胞核出现棕黄色或黄褐色染色为阳性，高倍镜下随机计数10个高倍视野计算阳性细胞比例。

6.各组大鼠心脏梗死区心肌组织中HIP-1α和BNIP3蛋白表达 取各组大鼠心肌梗死区组织，研磨均浆，加入蛋白裂解液，4℃下15 000×g离心10 min，取上清液，按BCA蛋白浓度检测试剂盒对蛋白定量。取总蛋白50μg，行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂奶粉封闭60 min，将一抗兔抗鼠HIP-1α和BNIP3多克隆抗体加入（稀释比例：1:1 000，1:1 500），4℃条件下过夜孵育，TTBS洗膜3次，加入二抗，室温下孵育120min，TTBS洗膜3次，暗室下加入电化学发光反应液，反应15 min，拍照，利用Quantity One 4.66图像分析软件以GAPDH为内参计算目的蛋白相对表达量。

表1 各组大鼠心脏功能比较（）

表1 各组大鼠心脏功能比较（）

注：与假手术组比较，a P＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05；与溶媒组比较，c P＜0.05

组别 数量 LVEDD/mm LVESD/mm LVEF/% FS/%假手术组 10 5.40±1.14 4.05±0.87 86.27±4.61 46.01±5.27模型组 10 10.54±2.50a 9.36±2.12a 51.09±5.53a 26.90±9.27a溶媒组 10 11.80±3.28a 8.66±1.53a 46.45±6.11a 27.46±6.55a 2ME两组 10 7.78±1.49abc 6.63±0.80abc 63.45±5.21abc 37.28±5.90abc F值 15.993 27.550 109.161 17.233 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

图1 TUNEL法各组大鼠心脏梗死区心肌细胞凋亡情况 A：假手术组；B：模型组；C：溶媒组；D：2ME两组，TUNEL（×200）

7.统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.各组大鼠心脏功能 四组大鼠LVEDD、LVESD、LVEF和FS差异有统计学意义（P＜0.05），模型组和溶媒组大鼠LVEDD和LVESD均高于假手术组，而LVEF和FS均低于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05），2ME两组大鼠LVEDD和LVESD均低于模型组和溶媒组，而LVEF和FS均高于模型组和溶媒组，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。

2.各组大鼠心脏梗死区心肌细胞凋亡情况假手术组、模型组、溶媒组和2ME两组大鼠心脏梗死区心肌细胞凋亡率分别为（3.83±0.83）%、（68.25±6.02）%、（71.29±8.51）%和（37.71±5.68）%，差异有统计学意义（F=280.515，P=0.000）；模型组和溶媒组大鼠心脏梗死区心肌细胞凋亡率均高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05），2ME两组大鼠心脏梗死区心肌细胞凋亡率低于模型组和溶媒组，差异有统计学意义（P＜0.05，图1）。

3.各组大鼠心脏梗死区心肌组织中HIP-1α和BNIP3蛋白表达 模型组和溶媒组大鼠心脏梗死区心肌组织中HIP-1α和BNIP3蛋白相对表达量高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05），2ME两组大鼠心脏梗死区心肌组织中HIP-1α和BNIP3蛋白相对表达量低于模型组和溶媒组，差异有统计学意义（P＜0.05，表2，图2）。

表2 各组大鼠心脏梗死区心肌组织中HIP-1α和BNIP3蛋白表达（）

表2 各组大鼠心脏梗死区心肌组织中HIP-1α和BNIP3蛋白表达（）

组别 数量 HIP-1α蛋白 BNIP3蛋白假手术组 10 0.21±0.07 0.36±0.06模型组 10 0.79±0.13 0.85±0.07溶媒组 10 0.75±0.04 0.83±0.06 2ME两组 10 0.56±0.05 0.62±0.07 F值 113.215 118.375 P值 0.000 0.000

图2 Western blot法检测各组大鼠心脏梗死区心肌组织中HIP-1α和BNIP3蛋白表达

讨论

近年来，急性心肌梗死发病率呈逐年升高的趋势[8]，已成为威胁社会及人群生命安全的重大公共卫生问题。目前，随着早期药物溶栓、冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路移植术等治疗方法的应用，在缓解患者症状及改善预后中发挥了积极的作用[9]，但在治疗过程中部分患者不可避免的发生了缺血-再灌注损伤，反而加重心肌损伤[10]。心肌缺血-再灌注损伤发生机制较为复杂，其中，心肌细胞凋亡与心肌缺血-再灌注损伤密切相关。因此，积极探讨缺血-再灌注损伤中心肌细胞凋亡相关机制，对减轻损伤改善预后意义重大。本研究利用结扎冠状动脉的方法构建大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，结果显示，模型组和溶媒组大鼠LVEDD和LVESD均高于假手术组，而LVEF和FS均低于假手术组，同时，模型组和溶媒组大鼠心脏梗死区心肌细胞凋亡率均高于假手术组，说明相比于假手术组，模型组和溶媒组心脏功能降低，且心脏梗死区心肌细胞凋亡率升高，提示成功制备了模型。

在正常生理条件下，HIP-1α半衰期比较短，经羟化、泛素化修饰等降解，低水平存在于细胞内[11]，而在缺血缺氧环境下，由于羟化酶活性降低，会诱导HIP-1α大量表达而蓄积于细胞内，通过作用于其靶基因BNIP3蛋白而介导细胞凋亡[12]。有研究指出[13]，BNIP3是缺血再灌注损伤心肌细胞死亡所必需的。2ME2作为雌激素小分子代谢产物，可通过抑制HIP-1α及血管内皮生长因子（VEGF）表达，一方面可减少血管增生，另一方面又可通过抑制HIP-1α及其下游靶基因BNIP3表达而减少细胞凋亡[14]。本研究结果显示，2ME两组大鼠LVEDD和LVESD均低于模型组和溶媒组，而LVEF和FS均高于模型组和溶媒组，说明2ME2可改善缺血-再灌注损伤大鼠心脏功能，同时，本研究结果显示，2ME两组大鼠心脏梗死区心肌细胞凋亡率低于模型组和溶媒组，说明2ME2可有效减少心脏梗死区心肌细胞凋亡率，具有心肌保护作用。本研究结果显示，模型组和溶媒组大鼠心脏梗死区心肌组织中HIP-1α和BNIP3蛋白相对表达量高于假手术组，说明HIP-1α和BNIP3可能参与了大鼠心脏梗死区心肌细胞凋亡，而2ME两组大鼠心脏梗死区心肌组织中HIP-1α和BNIP3蛋白相对表达量低于假手术组，说明2ME2可能通过抑制HIP-1α及其靶基因BNIP3蛋白而减少心肌细胞凋亡。

综上所述，2ME2可减少缺血-再灌注损伤大鼠梗死区心肌细胞凋亡，改善心脏功能，其机制可能与抑制HIP-1α及其靶基因BNIP3表达有关。