阿托伐他汀通过TGFβ1/miRNA208a信号抑制扩张型心肌病大鼠心肌胶原蛋白I的表达

赵明明 张金祝 李海德 尹桂华 姚宗芹 宋 杰 赵 蒙 付存玉

扩张型心肌病是一类以心力衰竭、猝死、恶性心律失常为临床表现的常见心肌病。给患者家庭和社会带来了沉重的经济负担。心肌纤维化是促进扩张型心肌病心功能恶化的关键因素[1]。逆转心肌纤维化可能是治疗扩张型心肌病的重要靶点，但扩张型心肌病心肌组织纤维化的发生发展机制目前尚不清楚。有研究表明转化生长因子β1（TGP-β1）/miRNA208a在多种病因所致心肌纤维化的发生、发展中皆起到重要作用[2]。但该信号通路是否在扩张型心肌病心肌纤维化中也起到重要作用，目前尚不清楚。

阿托伐他汀是一种新型羟甲基戊二酰单酰辅酶A还原酶抑制剂，具有降脂、抗炎、降低TGP-β1的表达等作用[3]。本研究拟使用阿托伐他汀作为干预措施，观察扩心病大鼠心肌组织中miRNA208a、TGP-β1、胶原蛋白I（COL-1）等指标，探讨阿托伐他汀对扩心病大鼠心肌组织纤维化的影响及其机制，从而为阿托伐他汀在扩张型心肌病中的应用提供实验依据。

材料与方法

1.实验材料 （1）实验动物：健康雄性，Wistar大鼠30只，7周龄，体质量220～240 g，购自山东省实验动物中心。随机分为正常对照组、扩张型心肌病（dilated cardio myopathy，DCM）模型组，阿托伐他汀处理组，每组10只。

（2）主要试剂及仪器：阿霉素（10 mg/瓶，共6瓶）购自北京嘉林药业有限公司。兔抗大鼠多克隆抗体、HE染色试剂盒、Masson染色试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德公司，阿托伐他汀片（20 mg/片，共7片）由瑞辉公司友情提供。

（3）动物模型制备：采用连续腹腔注射阿霉素法（2.5 mg·kg-1·w-1）制备扩张型心肌病大鼠模型[1]。

（4）正常对照组给予等剂量0.9%氯化钠溶液腹腔注射，共6周。模型制备成功后，阿托伐他汀处理组给予（12 mg·kg-1·d-1）灌胃。正常对照组、扩张型心肌病模型组给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃，共12周。

2.观察指标及方法 （1）大鼠心功能及基本指标：实验12周时，应用动物心脏彩超（HRQ-230 A）获取实验动物心功能相关指标，称量体质量，2%戊巴比妥钠针左下腹腔注射充分麻醉后，取出各组大鼠心脏，用0.9%氯化钠溶液清洗，称各大鼠心脏质量。

（2）HE染色法观察心肌病理学变化：4%甲醛溶液固定心肌组织，石蜡包埋，切片。石腊切片依次放入二甲苯，乙醇脱蜡，用蒸馏水浸洗后，苏木紫染色，0.1%盐酸乙醇分化；浸泡伊红液染色，风干后中性树胶封片，镜检观察。

（3）Masson染色观察心肌组织中胶原纤维的表达及含量：石蜡切片常规脱蜡至水洗；Weigert铁苏木精染液染核，1%盐酸酒精分化，丽春红酸性品红染液染色，1%磷钼酸溶液分化，甩干，苯胺蓝染液复染，1%冰醋酸冲洗切片，快速水洗后，乙醇脱水，二甲苯透明、风干后中性树胶封片，镜检并摄片；随机选取5个视野，Olmpus-BX50显微镜摄像系统摄像，胶原纤维呈蓝色，肌肉、胞浆呈红色，细胞核呈蓝黑色。用高清晰彩色图文报告分析系统分析，计算每个视野的心肌胶原面积与心肌总面积比值即心肌胶原容积分数。

（4）RT-PCR检测心肌组织中TGP-β1、miRNA208a、内皮素（ET）、βMHC、COL-1表达水平：Trizol法提取总RNA，严格按RT-PCR试剂盒说明操作，各检测指标引物序列如下：GAPDH上游5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下 游：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′；TGP-β1上 游：5′-GCGATCTAACCTGTTGCCTG-3′，下 游：5′-AGCCATGGAGTAGACATCCG-3′；βMHC上 游：5′-TACGATTATGCGTTCTTCTCCC-3′，下 游：5′-TCCTCCCTCTGCTTCTGTTTG-3′；ET上游：5′-TGTGTCTACTTCTGCCACCT-3′，下游：5′-CTGCATGGTACTTTGGGCTC-3′；COL-1上 游：5′-TGACTGGAAGAGCGGAGAGT-3′，下 游5′-GAATCCATCGGTCATGCTCT-3′；U6上游5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下 游5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′；hsa-miR208a-5p loop primer5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCTTTTTG-3‘F primer 5′-TGCGCATAAGACGAGCA-3′mircoRNA反义链通用引物序列5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。RT-PCR反应条件：50℃2 min，95℃10 min；95℃30 s，60℃30 s，40个循环。绘制溶解曲线，最终数据以2-△△Ct进行分析。（RT-PCR仪器型号QuantStudio 6）

（5）Western blot法检测心肌组织中TGP-β1、ET、βMHC、COL-1表达水平：石蜡组织切片脱蜡后行抗原修复封闭，然后分别滴加兔多抗GAPDH抗体（1:1 000稀释），鼠单抗ET（1:1 000稀释），鼠单抗βMHC（1:500稀释），兔多抗TGFβ1（1:1 000稀释），鼠单抗COL-1（1:1 000稀释），4℃孵育过夜，TBST洗去多余一抗后分别滴加封闭液稀释（1:50 000稀释）的HRP标记羊抗小鼠、羊抗兔二抗。TBST洗去多余二抗后滴加工作液覆上保鲜膜，X光胶片压片、显影、定影、冲洗胶片用BandScan分析胶片灰度值。

3.统计学分析 采用SPSS19.0软件进行统计学分析。所有计量数据用均数±标准差表示，三组间比较采用单因素方差分析分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.动物心脏彩超结果 实验动物心脏彩超结果表明，与对照组相比，扩心病模型大鼠心脏指数增加，大鼠LVEF降低，LVEDD明显增大，差异具有统计学意义。阿托伐他汀组与扩心病组比，LVEF提高、LVEDD减少，差异具有统计学意义。详见表1。

表1 两组大鼠心脏彩超结果比较（）

表1 两组大鼠心脏彩超结果比较（）

注：与对照组相比，*P＜0.05，与扩心病组相比，#P＜0.05

项目 对照组（n=9）扩心病组（n=9）阿托伐他汀组（n=9）体质量/g 367±15.5 250.5±15.6* 296.1±24.4#心脏指数/（mg/g） 2.02±0.1 2.89±0.43* 2.28±0.27#LVEDD/mm 6.34±0.39 7.60±0.52* 6.85±0.26#LVESD/mm 3.25±0.38 3.76±0.16* 3.41±0.15#LVEF% 91.3±1.65 74.1±2.78* 78.6±2.55#

2.心脏HE染色结果 对照组心肌纤维走形正常，排列紧密，心肌细胞结构清晰；扩心病组心肌纤维走形一致，细胞间质模糊，细胞肥大、水肿。阿托伐他汀组仍见细胞肥大、水肿。心肌纤维排列稀疏，走形基本正常（图1）。

3.Masson染色结果 对照组心肌间质见少量胶原纤维分布，扩心病组胶原纤维较对照组明显增多（P＜0.05），而经阿托伐他汀处理后心肌间质胶原纤维含量降低（P＜0.05，图2）。

4.RT-PCR结果 与对照组相比，扩心病组microRNA208a表达量及TGFβ1、ET、βMHC、COL-1 mRNA的表达量明显增加，差异具体统计学意义（P＜0.05）。与扩心病组相比，阿托伐他汀大鼠心肌组织中microRNA208a表达水平及TGFβ1、ET、βMHC、COL-1 mRNA的表达水平降低，差异具有统计学意义（P＜0.05，图3）。

5.Western blot结果 与对照组相比，扩心病组TGFβ1、内皮素（ET）、βMHC、胶原蛋白1（COL-1）蛋白的表达量明显增加，差异具体统计学意义（P＜0.05）。与扩心病组相比，阿托伐他汀组大鼠心肌组织中TGFβ1、ET、βMHC、COL-1蛋白的表达量降低（P＜0.05）结果与RT-PCR检测的上述指标的mRNA的表达水平一致。差异具有统计学意义。提示阿托伐他汀可减轻扩心病大鼠模型心肌组织中TGFβ1、ET、βMHC、COL-1的过表达（图4）。

图1 各组大鼠心肌组HE染色（×400）A：对照组；B：扩心病组；C：阿托伐他汀组

图2 各组大鼠心肌组Masson染色（×400）A：对照组；B：扩心病组；C：阿托伐他汀组

图3 各组microRNA208a及TGFβ1、ET、βMHC、COL1的mRNA表达量 A：三组miRNA208a表达量的比较；B：三组TGFβ1mRNA表达量的比较；C：三组ET mRNA表达量的比较；D：三组βMHC mRNA表达量的比较；E：三组COL1 mRNA表达量的比较；注：与对照组相比，*P＜0.05，与扩心病组相比，#P＜0.05

图4 各组microRNA208a及TGFβ1、ET、βMHC、COL1的mRNA表达量A：对照组；B：扩心病组；C：阿托伐他汀组；注：与对照组相比，*P＜0.05，与扩心病组相比，#P＜0.05

讨论

心肌纤维化是扩张型心肌病的重要病理生理变化。高糖可通过TGP-β1/Smad2信号通路促进心肌纤维化，导致心功能下降[5]。抑制该信号通路则可减轻心肌纤维化程度[6]。ERK1/2可通过TGFβ1信号旁路促进骨膜素的表达。而骨膜素是心肌纤维化的关键调节因子[7]。TGP-β1可促进Rho相关激酶（ROCK）过表达，从而抑制BMP-2的表达，促进心肌组织纤维化[8]。除此以外，TGFβ1还可以与血管紧张素转化酶2型受体结合直接导致纤维组织生成和胶原蛋白表达增多。减少TGP-β1的表达可能为一种逆转心肌纤维化的重要方法。

miRNAs是一类大小约22核苷酸的非编码RNA，多种miRNA参与了心肌纤维化的发生、发展[9-11]。miRNA208a是miRNA208家族一员，由β—MHC基因编码，特异性表达于心肌组织。在心肌梗死大鼠模型中，miRNA208a促使心肌纤维化、肥大。降低miRNA208a的表达，可减轻心肌纤维化的程度[12]。抑制miRNA208a的表达可减轻高盐饮食大鼠心肌肥厚及周围血管纤维化程度[13]。机械牵张H9C2细胞可通过TGP-β1刺激miRNA208a的表达，从而促进心肌细胞肥大及内皮素、COL-1生成[14]。miRNA208a主要通过其靶标内皮素、β-MHC发挥其致心肌纤维化及心肌细胞肥大作用。内皮素是一种跨膜糖蛋白，与TGFβ1具有共同受体。可调节TGFβ1在细胞外基质中的合成作用。目前已有研究表明miRNA208a与扩张型心肌病患者的LVEF成正相关，与左心室收缩末期容量指数呈负相关。是很强的心脏不良事件发生率及心脏源猝死的重要预测因子，但其在扩张型心肌病的发生、发展中发挥作用的具体机制目前尚不清楚[15]。

本研究应用阿霉素制造扩张型心肌病大鼠模型，心脏彩超示心脏指数（mg/g）LVEDD、LVESD均明显增大。免疫组织化学进一步提示心肌间质纤维化程度较正常对照组重。同时我们发现其心肌组织TGP-β1、miRNA208a、内皮素、βMHC、COL-1高表达。提示TGP-β1/miRNA208a信号通路在扩张型心肌病心肌纤维化的发生发展中起到重要作用，与COL-1的高表达密切相关。因此干预此信号通路可能降低心肌纤维化程度，从而改善心功能。阿托伐他汀是一种新型羟甲基戊二酰单酰辅酶A还原酶抑制剂。有研究表明，阿托伐他汀可通过抗炎作用抑制兔钙化性主动脉瓣疾病病变发展进程[16]；可降低扩张型心肌病患者血清炎症因子水平[17]。田艳等研究发现阿托伐他汀可降低扩张型心肌病大鼠心肌组织中TGFβ1的表达，降低心肌纤维化[18]。通过本研究，我们观察到经阿托伐他汀处理后大鼠较扩心病组大鼠LVEDD、LVESD缩小，射血分数增高，表示阿托伐他汀具有一定改善扩心病心肌重构作用。同时通过心肌Masson染色，我们观察到，经阿托伐他汀处理后大鼠心肌组织纤维化程度明显降低。我们进一步证实阿托伐他汀改变了扩张型心肌病模型大鼠心肌组织中TGFβ1/miRNA208a信号通路的表达。我们推测其降低心肌纤维化的左右 与其对该信号的调节有关。其机制可能与其具有一定的抑制炎症反应有关。

综上所述，本实验结果表明，阿托伐他汀具有一定减轻扩心病大鼠心肌纤维的作用，该作用与 可能与其抑制TGFβ1/miRNA208a信号通路，降低COL-1的表达相关。但对其具体药理作用机制尚需进一步研究；阿托伐他汀抗炎、抗氧化作用是否与该途径有关仍需进一步研究。