原位分离技术在乙醇发酵体系中的应用可行性研究

蔡 闯，白从广，罗 霞，毕研芳

（江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁223800）

微生物的发酵过程往往会受到各种条件因素的影响，其中包括发酵产物的反馈抑制作用，发酵环境改变的抑制作用。这些因素也使得整个体系中的发酵底物利用率降低，更多的物质被用于发酵菌群的代谢与生长，导致前体产物以及目的产物的合成量降低。为解决这一难题，业内普遍通过诱变筛选耐抗性强的菌株用于发酵生产，但由于筛菌过程繁琐、难以确定诱变方向及菌种自身易退化等缺点的存在，寻找一种全新高效的方法十分迫切。原位分离技术的提出正出于这一目的，从发酵产物与体系入手，在发酵过程中分离出对细胞生长具有毒副性以及产物积累具有抑制作用的产物，该技术有以下优点：促进发酵产物的合成，提高发酵底物利用率，简化发酵后续产物分离纯化的工作[1]。

原位分离技术对于反馈抑制作用强的发酵体系，如疫苗、抗生素等具有显著的效果，目前已有广泛应用。经过多年研究，已有成熟的研究成果及实践经验，通过使用萃取、蒸馏、结晶、吸附等分离纯化手段，根据产物的独特理化性质如基团、相对分子量、极性的不同，可实现准确地从发酵体系中分离一种或几种产物的目的，从而达到改善发酵体系内环境与削弱反馈抑制作用。

当发酵体系内有以下几种情况时，可以选择原位分离技术：a.部分发酵产物（代谢产物、次级代谢产物、副产物）对发酵菌群具有毒副作用与反馈抑制作用；b.发酵产物本身对发酵菌群具有毒副作用与反馈抑制作用；c.随着发酵的进行，发酵体系内环境改变对发酵菌群的毒副作用与反馈抑制作用[2]。以乙醇作为发酵产物的发酵体系为例，前期发酵菌群次级代谢反应旺盛，其代谢产物可能会影响乙醇的进一步合成，并且会改变发酵体系环境如pH值、碳氮源的含量等，加之乙醇本身的抑菌作用，这些因素都会对发酵体系内的发酵菌群产生影响，所以能够由发酵体系中分离出乙醇及其代谢产物，则对于发酵体系内发酵水平的提升具有积极的帮助和意义。

与其他发酵行业相比，白酒的酿造具有繁多的发酵菌体系、复合的发酵底物、复杂的发酵产物等特点，所以原位分离技术在传统白酒酿造中的研究应用尚属空白。而原位分离技术在白酒酿造中的应用具有极强研究价值，不仅可以揭示部分白酒发酵过程的变化，也对实际生产具有积极的意义。

其实在传统工艺中，原位分离的实验思路早有应用，“抽黄水”和“打量水”的操作体现得尤为明显。黄水是酿酒发酵过程中的一类发酵产物。随着发酵的进行，酒醅中未被微生物所利用的水分与微生物代谢生产的水逐渐向下渗透，并伴随着可溶性淀粉、单宁、酒醅中的有机酸、酵母浸出物、香味前体物质及还原糖等可溶于水的物质沉降于窖底，进而形成了黄水。黄水的成分十分复杂，不仅包含了大量的上述可溶性物质，还在其中发现了丰富的微生物菌群以及醇、醛、酸、酯等香味物质。抽取黄水在酿酒生产中具有减水，降酸的意义[3]。

粮糟蒸馏后，需要立即加入约85℃的热水，这一操作被称为“打量水”。打量水的加入一方面增加粮糟水分，促进淀粉的糊化；另一方面降温过程中蒸汽带走了粮糟中大量的挥发酸，然后才进行撒曲操作。摊晾也称扬冷，使出甑的粮糟迅速降低温度，这一工艺挥发了部分酸与水分，使得粮糟适宜入窖发酵。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

菌种：从曲块中直接挑取的发酵菌群。

仪器设备：PHS-3C pH计(上海精科)；FA2004B分析天平(上海精科)；D420生物培养摇床(Thermo Electron)；高效液相色谱仪（Agilent 1200 Series）；自动发酵罐(BioPAT)；D-37520冷冻离心机(Thermo Electron)；双蒸水取水仪 (Thermo Electron)。

发酵培养基：葡萄糖100 g/L、酵母浸膏8 g/L、（NH4）2SO45 g/L、KH2PO41.5 g/L、MgSO45 g/L·7H2O 0.55 g/L、CaCl20.15 g/L。

1.2 实验方法

1.2.1 乙醇发酵

配制发酵培养基4 L，BioPAT发酵罐中灭菌后按1%接种量接种发酵菌种，220 r/min发酵72 h，采集实验过程数据，发酵结束后离心发酵液，上清液待测乙醇浓度。

1.2.2 HPLC法测乙醇浓度

取20 μL经0.45 μm孔径的滤膜过滤后进行液相检测，检测条件：流动相为5 mmol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，柱温25℃。根据相应峰面积在标曲中计算乙醇浓度。

1.2.3 乙醇吸附实验

树脂、沸石等吸附材料预处理后，分别称取等量吸附剂放入三角瓶中，加入相同体积与浓度的溶液，置于一定转速和温度的摇床中，达吸附平衡后，测定溶质浓度，比较吸附能力。

2 结果与分析

2.1 乙醇的原位分离实验

乙醇是一种酶抑制剂，一定浓度的乙醇会阻遏发酵体系中微生物酶的正常代谢合成；一定量浓度的乙醇对发酵体系中微生物群有毒副作用。所以我们选择乙醇作为分离产物进行原位分离发酵研究。

2.1.1 乙醇吸附剂的选择（表1）

由表1可知，几种材料中活性炭对乙醇具有最大的吸附容量，缺点是其无差别吸附的选择性，并且乙醇等被吸附物质脱附时阻力较大。而硅质岩由于其疏水性较强，如Milestone等人所证实，更适用于对于非极性更强的长链醇的吸附，如丁醇、异丁醇、异戊醇等的吸附分离效果较乙醇更佳。并且沸石作为吸附剂对乙醇进行原位分离时，因为具有离子交换性，发酵液中的某些离子会与其进行离子交换，从而出现生物不相容性的问题，破坏连续发酵体系。常使用吸附树脂不采用离子交换树脂进行吸附分离的原因是乙醇在发酵体系中大部分时间表现出非离子状态。加之吸附树脂的优良可塑性，即可以通过选择适当的单体、交联剂和致孔剂对吸附树脂孔的结构进行调制，再通过化学手段改变树脂表面的理化性能，从而有选择性的合成出乙醇吸附性能优良的新型树脂。这在乙醇吸附分离实际应用中极具研究价值，发展前景十分广阔[4]。

2.1.2 吸附树脂的吸附原理（图1）

醇类的烷基链与吸附树脂上的疏水基团具有强烈的相互作用力是吸附树脂对醇类进行吸附的主要作用力。对于醇类而言，疏水性与碳链长短相关，碳链越长，也就越容易被吸附[5]，由于乙醇的碳链较短，疏水性弱，再加之乙醇分子的极性小于水的极性，吸附树脂的特性以疏水性中等极性吸附能力为选择方向。

乙醇的羟基可与树脂表面酯基形成氢键，而乙醇分子的疏水碳链与树脂疏水性表面又以范德华力相互作用，从而将乙醇从醇-水溶液中吸附出来。首先吸附质分子通过对流或扩散（1）到达树脂颗粒的边界液膜层，然后在液膜层内通过薄膜扩散（2）到达树脂孔隙结构，通过孔隙扩散（3a）以及表面扩散（3b）到达树脂吸附位点，根据动力学原理（4）进行吸附[6]。

2.1.3 MR 11树脂的基本理化性质

MR 11是一种典型的等极性树脂，我们选择其作为乙醇的吸附剂进行试验操作，结果见表2。

2.1.4 MR 11树脂的动力学特性

准确称取相同质量经过预处理后的吸附树脂3份放置于三角瓶中，再加入同体积、不同浓度的乙醇溶液，保持相同温度和转速，直至吸附树脂吸附平衡。测得吸附前后乙醇的初始浓度Co和平衡浓度Ce，计算吸附容量Q，再以Qe-Ce绘制该树脂的吸附等温线。做平行实验3次，确保实验准确性。

表1 各类吸附材料吸附-脱附性能比较

图1 吸附作用示意图

表2 MR11树脂结构及基本参数

吸附温度分别取20℃、40℃和60℃ 3个温度，获得乙醇溶液于MR 11树脂上的吸附等温线。MR 11树脂对乙醇的吸附平衡数据见表3。由图2可知，吸附量与溶液温度呈反比，表明树脂吸附过程是放热过程。对实验数据分别采用线性等温线方程、Langmuir-Freundlich等温线方程进行拟合的结果如下所示。

线性等温方程式：Qe=HCe

式中：H—亨利常数，L/g。

Langmuir—Freundlich等温线方程式：

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式中：a，b——Langmuir-Freundlich等温线方程常数，L/g；

n——Langmuir-Freundlich等温线方程指数参数。

由公式可以看出，Langmuir-Freundlich公式是Langmuir公式和Freundlich公式的整合形式。当指数n为1时，公式转变为Langmuir公式；当常数b的值很小或浓度很低时，变形为Freundlich公式。

可以看出，在20℃、40℃和60℃ 3个温度条件下，吸附平衡数据可以很好的拟合与线性等温线方程和Langmuir-Freundlich等温线方程，其中Langmuir-Freundlich等温线方程的拟合度更高，相关性系数可达到0.9978以上。所以，实验温度范围内的乙醇溶液在树脂MR ll上的吸附平衡数据满足Langmuir-Freundlich等温线方程。

2.1.5 MR ll树脂的吸附动力学研究

准一阶、二阶动力学模型是常用来描述吸附质吸附速率快慢的两组模型。与化学反应的研究内容相似，吸附速率可以理解为化学反应的速率。模型使用有效传质系数来概括溶液吸附过程中的所有传质阻力，该系数受多种机理影响。实验原理为将固定浓度、体积的目标物质溶液倒入三口烧瓶中，经水浴预热至实验要求的温度后，加入相同质量经预处理的吸附树脂进行吸附，立即搅拌计时，间隔一定时间测定溶液浓度Ct。以Ct-t绘制吸附动力学曲线。

表3 MR 11对乙醇吸附等温线方程参数及相关系数

图2 不同温度下乙醇在MR 11树脂上吸附的Langmuir-Freundlich模型拟合

分别在20℃和60℃温度下测定MR ll树脂在乙醇溶液中的吸附动力学参数。MR ll树脂对乙醇的吸附动力学拟合结果见图3、表4。

图3 不同温度下MR 11在乙醇溶液中吸附准一阶、准二阶动力学模型拟合

准二阶吸附动力学方程：

式中：K1：准一阶动力学方程速率常数，S-1；

表4 不同温度下MR11在乙醇溶液中吸附的动力学参数和相关系数

由图3可见，MRll树脂对乙醇约5 min即可到达吸附平衡，表明溶液在较高的流速下也可进行吸附操作。此外，准二阶动力学方程比准一阶方程对吸附数据的拟合度高，相关性系数也更好，证明实验温度范围内，MRll在乙醇溶液中的吸附动力学更符合准二阶动力学模型。在20℃和60℃下，吸附过程具有接近的速率常数，说明吸附速率受温度影响较小。

2.2 乙醇的发酵反馈抑制作用

2.2.1 乙醇的摇瓶发酵模拟

自由发酵乙醇条件下我们对体系pH值进行测定，结果见图4。

图4 自由发酵过程pH值变化

由图4可知，酵母菌的发酵过程体系pH值首先呈下降趋势，原因是这一阶段属于酵母菌指数增长期，酵母菌大量代谢产酸以及其他酸性产物，到达稳定期后，酵母菌更多进行目的产物的合成即我们所说的酒精以及其他风味物质发酵，而此时随着pH值降低，体系产物过剩以及发酵底物的大量消耗，酵母菌进入衰亡期，同时进行大量的菌体自溶，释放胞液；其次，随着体系内还原糖的消耗，酵母菌开始利用有机酸作为碳源持续释放钠离子，与此同时，利用菌体自溶释放的氨基酸作为碳源合成铵离子，所以发酵后期的pH值持续升高。

图5 不同初始乙醇浓度下酵母菌的生长曲线

由图5可知，适宜的乙醇浓度对于酵母菌的生长具有促进作用，从生长曲线来看，能够较快度过指数期，进入稳定期，此时菌群数量达到最大，进入发酵期获得最大的发酵速率，同时减少了指数增长期的次级代谢产物以及消耗的底物碳氮源等成分。

由图6可看出，过低的pH值会影响发酵菌群菌体的生长，在不改变pH值与发酵产物浓度情况下，会大量导致菌体死亡，pH5时，还原糖的消耗主要用于菌体生长，所以过高的pH值会让还原糖更多的用于菌体自身代谢发育。

由图7可看出，在发酵初期，pH值均会经历一个下降的过程，此发酵过程的生物量处于一个较低的水平，还原糖的消耗加快，A中较低的乙醇含量使生物量获得了较快的增长速度，但后期发酵体系过低的pH值又使发酵体系内生物量迅速下降，而菌体死亡时胞内释放的胺类物质使整个体系pH值回升；BC中，发酵过程接近，发酵液经测定也获得了最大的乙醇产率；D中尽管发酵菌群发育最快，但后期发酵体系pH值偏高，这让其生物量无法始终维持在一个较高的水平，并且乙醇含量过高导致发酵菌体提前进入衰亡期，可能是乙醇的反馈抑制作用影响了菌群的发育过程，而菌体的死亡又使后期发酵体系的pH值保持在较高的水平（4.5左右）。

2.2.2 发酵体系的发酵效率与比发酵量（图8、图9、图10）

图6 pH值对于整个发酵体系影响

图7 乙醇初始浓度对于整个发酵体系影响

图8 初始乙醇含量对发酵影响（72 h计）

引入比发酵量和发酵效率两个新概念，比较不同发酵体系乙醇浓度与体系内生物量、还原糖消耗的关系，转变以往直观检测乙醇浓度评价发酵体系的旧思路，注重分析发酵过程中发酵菌的发酵能力以及体系内碳源转化为乙醇的效率，目的在于开发旧有发酵模式的内在潜力以及调控空间。

图9 不同乙醇初始浓度下发酵体系的菌体比发酵量与发酵效率

图10 乙醇的反馈抑制作用及MR 11原位分离发酵

结果表明，乙醇产量与初始乙醇浓度呈正比，与还原糖的利用率不相关，当乙醇浓度为5%时，发酵体系获得最大的发酵底物利用率和生物量，当乙醇浓度到达6%时，还原糖利用率开始降低，乙醇的产量提高不明显，这是因为高浓度乙醇会抑制酵母菌的合成代谢，随着乙醇浓度的不断增加，比发酵量呈上升趋势，这表明，随着乙醇浓度增加，一方面菌体生长受到抑制，另一方面更多的碳源参与菌体本身代谢活动以及其他代谢途径。

由图10可知，乙醇的反馈抑制作用并不十分明显，添加乙醇后，发酵总乙醇浓度为3.31 g/L，不添加乙醇的发酵产量约为1.41 g/L。而添加了MR ll树脂的发酵产量达到了1.76 g/L，产量提高了24.8%，原位分离发酵实验的比发酵量为0.92，较空白对照0.86提高了18.8%，发酵效率则提高了13.38%。

3 总结

由于乙醇对于发酵体系具有反馈抑制作用，所以引入原位分离技术对发酵体系具有积极的调节作用，实验通过对技术原理的分析，选取适宜的吸附分离材料，并通过实验室摇瓶实验验证了其可行性，并预期实现以下两点效果：

（1）缩短发酵时间：采用适当措施对发酵过程进行干涉，即发酵过程中适当分离出部分乙醇及其他发酵产物，一方面促进酵母菌生长（去反馈抑制效应，控制体系pH值），另一方面由于产物的分离从而加速了发酵体系正向反应速率。

（2）对发酵底物更加充分利用，实验表明，采用原位分离技术，发酵体系内菌群总量增加17.4%，还原糖的利用率得到有效的提高，比发酵量提高18.8%，发酵效率则提高了13.38%。

但是也应该认识到酿酒相对于其他发酵工艺有很多独特的地方，比如繁多的发酵菌体系，复合的发酵底物，复杂的发酵产物，所以很多实验室研究方法无法模拟现实生产的复杂情况，而这也是赋予白酒丰富风味的重要因素，实验室研究无法兼顾到其他风味物质的影响。而且原位分离装置的引入生产也是一个十分重要的过程，不然研究只能流于表面，难以获得实质的进展。

白酒的酿酒工艺经过几千年的发展与前人不懈的钻研研究，已经具有了一个完整的科学系统理论体系，应该说白酒行业是一个掺杂着传统工艺与现代科学的综合产业，纵观白酒工艺的发展，在传统工艺的基础上，从事白酒行业的科研人员一直不断地对其理论与操作进行研究，借鉴同行业的经验包括相关行业的优秀成果，对于企业的文化与科研建设具有重要的意义。