复方中药延缓秀丽线虫衰老的作用研究

杨龙旺，陈珺，林菁，潘文锋，黄泽波

(广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006)

中医将黄芪(Astragalusradix)、何首乌(Polygonimultifloriradix)和熟地黄(Rehmanniaeradixpraeparata)归为补虚药，认为它们具有平衡人体阴阳虚衰的功效[1]。黄芪最初载于《神农本草经》，为蒙古黄芪或荚膜黄芪的干燥根，具有补气升阳之功效，现代用单味药治疗心脏疾病；何首乌首载于《何首乌传》，药用部位为干燥块根，主要用于血虚诸证，现代通过配伍治疗神经衰弱和高血压等；熟地黄首载于《本草拾遗》，用于血虚和肝肾阴虚诸证。模式动物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans，以下简称秀丽线虫)不仅具有生命周期短、实验操作简单等优点[2]，而且其关键信号通路与人类同源性高，因而是研究天然产物和中药活性的理想动物模型[3]。我们曾以秀丽线虫为模型发现黄芪多糖不仅具有延缓衰老的作用，而且还能缓解多聚谷氨酰胺和6-羟多巴胺引起的神经毒性因而具有抗神经退行性疾病的潜在活性[4-5]。

衰老是人体各项机能衰退的综合表现[6]，补虚药具有调节免疫、内分泌系统和神经系统的功能[7]，因而具有改善人体机能的潜在功效。据此，本文选用以黄芪、何首乌和熟地黄等补虚药为主的复方汤剂，使用不同极性的化学试剂对复方汤剂进行萃取得到相应的萃取部位，并以对秀丽线虫模型寿命的影响来探讨各个部位的抗衰老作用。

1 材料

1.1 试剂 乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氨水、三氯甲烷、二氯甲烷(天津市鼎盛鑫化工有限公司)；2,2-二苯基-1-苦肼基(上海麦克林生化科技有限公司)；氯化铝、浓硫酸、香草醛(天津市科密欧化学试剂有限公司)；琼脂(上海伊卡生物技术有限公司)；胰蛋白胨、酵母提取物(英国Oxoid公司)；氨苄青霉素、5-氟尿嘧啶(美国Sigma公司)。

标准品：二苯乙烯苷、芦丁、黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷(河南省商城县标物商贸有限公司伏山分公司)；D-(+)葡萄糖(阿拉丁)；旱莲苷A、毛蕊花糖苷(广东省药品检验所)；所有标准品含量均大于或等于98%。

秀丽线虫和菌种：秀丽线虫N2和大肠杆菌(OP50和NA22)购买于美国明尼苏达大学秀丽线虫遗传学中心(CaenorhabditisGenetics Center)。作为秀丽线虫的食物，大肠杆菌OP50用于固体培养、NA22用于液体培养。

1.2 仪器 冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；纯水仪(上海和泰仪器有限公司)；紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)；薄层板(青岛基亿达硅胶试剂有限公司)；紫外-可见光分光光度计(上海元析仪器有限公司)。

2 方法

2.1 复方汤剂的制备 本文复方汤剂以黄芪、何首乌和熟地黄等药材为主，加水熬煮而成。

2.2 提取部位分离 复方汤剂的分离按如图1所示的分离流程进行。首先将200 mL原始汤剂和4倍体积的95%乙醇混合均匀，在4 ℃放置过夜后离心(6 620 rpm，10 min)。沉淀物用乙醇洗涤3次，于50 ℃水浴挥干残留乙醇，再加适量水溶解，采用Sevag法除去蛋白，得到多糖部位；上清液依次使用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，正丁醇层另外再用等体积氨水洗涤，依次得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、氨洗涤部位和剩余水部位。所有部位在40 ℃水浴减压浓缩至干，再继续浓缩30 min以保证除去残留的化学试剂，再各加适量水溶解，冷冻干燥，得到最终的分离部位备用。

图1 复方汤剂的分离流程

2.3 秀丽线虫寿命试验 秀丽线虫寿命试验参考Zhang等[4]的方法进行。将产卵期的秀丽线虫裂解，将虫卵转移至S Medium液体培养基，在20 ℃、120 rpm和无食物条件下孵育23 h，然后加入食物细菌继续培养至即年轻成虫期，转移至96孔板进行寿命试验。每孔总液体体积100 μL、虫数20条左右，添加5-氟尿嘧啶(终浓度75 μg·mL-1)、氨苄青霉素(终浓度100 μg·mL-1)和食物(NA22细菌)。药物浓度梯度设置为0.25、0.5、1、2、4、8 mg·mL-1，另外设置不加任何药物空白组。在20 ℃、120 rpm条件下培养，10 d后每隔2 d统计1次秀丽线虫的存活状况，直至全部死亡。

2.4 薄层色谱分析 薄层色谱鉴定方法参照《中国药典》2015年版进行[8]。标准品溶液制备：称取标准品1 mg，加1 mL甲醇溶解；供试品溶液制备：称取样品5 mg，加1.5 mL甲醇溶解；点样、展开和显色：用玻璃毛细管分别蘸取约10 μL标准品溶液和供试品溶液，点样于硅胶薄层板上，使用现配的展开剂展开。

毛蕊花糖苷鉴定：使用乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸=32∶1∶4溶剂展开，板面涂抹0.1%的2,2-二苯基-1-苦肼基乙醇试液；二苯乙烯苷鉴定：使用三氯甲烷∶甲醇∶水=20∶10∶1溶剂展开，在波长365 nm的紫外光下检视；芦丁鉴定：使用乙酸乙酯∶甲醇∶水=8∶1∶1溶剂展开，板面喷涂5%的氯化铝乙醇试液，热风加热后，在365 nm紫外光下检视；黄芪甲苷鉴定：使用三氯甲烷∶甲醇∶水=13∶7∶2溶剂展开，涂抹10%硫酸乙醇试液，热风吹至显示清晰的斑点；毛蕊异黄酮葡萄糖苷鉴定：使用三氯甲烷∶甲醇∶水=75∶25∶2溶剂展开，晾干后在254 nm紫外光下检视；旱莲苷A鉴：使用二氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=30∶40∶15∶6溶剂展开，板面涂抹5%的香草醛硫酸试液，热风吹至板面出现清晰的斑点。

2.5 总糖含量测定 多糖部位总糖含量测定方法参照《中国药典》2015年版进行[8]。精密称取多糖样品20 mg加水溶解，置50 mL容量瓶中并稀释至刻度，取5 mL定容至50 mL，摇匀。取供试品溶液2 mL，加4%苯酚溶液1 mL混匀，迅速加入硫酸7.0 mL，摇匀。于40 ℃水浴中保温30 min后取出，置冰水浴中5 min，以相应试剂为空白在490 nm处测定吸光度。

3 结果

3.1 复方汤剂对秀丽线虫寿命的影响 原始汤剂以黄芪、何首乌和熟地黄为主组成，由于这些补虚药具有生津养血、乌须发的作用[1]，所以本文首先检测了原始汤剂对秀丽线虫寿命的影响。如图2所示，原始汤剂对秀丽线虫寿命有一定的延长作用，但与汤剂浓度有关。当原始汤剂浓度为2 mg·mL-1时，秀丽线虫的平均寿命有较明显的提高(见图2和表1)，说明原始汤剂具有抗衰老的潜在作用。

图2 复方汤剂对秀丽线虫寿命的影响

汤剂浓度/mg·mL-1平均值±SE/d中位值/d最大值/d动物数(条)P值017.07±0.461733165-0.2516.95±0.3915331580.506 40.517.23±0.4715351310.995 4117.58±0.4815391550.442 6219.85±0.5619391510.000 2416.22±0.5715391480.550 9816.25±0.7211391470.641 9

3.2 复方汤剂萃取部位的质量和提取率 由于原始汤剂对秀丽线虫寿命有一定的延长作用，但与其浓度有关，因此本文接着对原始汤剂进行了萃取分离，得到多糖部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、氨洗涤部位和剩余水部位等6个部位，其质量和提取率见表2。其中，多糖部位提取率最高，达8.6%，但石油醚部位和经氨水洗涤后的正丁醇部位的提取率不到1%。

表2 复方汤剂分离部位的质量和提取率

3.3 复方汤剂萃取部位对秀丽线虫寿命的影响 根据上述结果，本文利用秀丽线虫寿命实验对所得萃取部位进行了检测。其中，石油醚部位含量过低，没有开展寿命实验。正丁醇部位在给药第13天、氨洗涤部位在给药第10天时，秀丽线虫基本死亡，实验终止。乙酸乙酯部位和剩余水部位对秀丽线虫的寿命没有延长作用，但多糖部位表现出一定的寿命延长作用。如图3和表3所示，当浓度为8 mg·mL-1时，多糖部位对秀丽线虫的平均寿命提高了约10%。由于多糖部位具有潜在的抗衰老活性，本文采用苯酚浓硫酸法对其总糖含量进行了测定，结果显示其糖含量为50%。

图3 复方汤剂多糖萃取部位对秀丽线虫寿命的影响

样品浓度/mg·mL-1平均值±SE/d中位值/d最大值/d总虫数(条)P值016.69±0.391725115-0.2518.12±0.4717401280.098 10.517.94±0.4417401290.061 9117.64±0.4117401270.193 9217.83±0.3817401440.127 6417.87±0.4517371380.170 4818.58±0.721737860.001 3

3.4 复方汤剂主要代表成分的鉴定 本文原始汤剂以黄芪、何首乌、熟地黄等为主组成，据此本文对原始样品和分离所得部位的代表性成分用薄层色谱进行了鉴定。如图4所示，与标准品对比，存在5种化合物:芦丁(乙酸乙酯部位)、旱莲苷A(乙酸乙酯部位)、二苯乙烯苷(石油醚部位)、黄芪甲苷(正丁醇部位)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(正丁醇部位)。

A.旱莲苷A的鉴定；B.毛蕊花糖苷的鉴定；C.二苯乙烯苷的鉴定；D.芦丁的鉴定；E.黄芪甲苷的鉴定；F.毛蕊异黄酮葡萄糖苷的鉴定。色谱板中样品a～g分别为原始汤剂、多糖部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、氨洗涤部位和剩余水部位；样品h～m分别为旱莲苷A、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、芦丁、黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准品图4 复方汤剂中代表性成分的薄层板色谱鉴定

4 结论

本文首先检测了原始复方汤剂对秀丽线虫寿命的影响，发现原始汤剂对秀丽线虫寿命有一定的延长作用，但与汤剂浓度有关。接着通过对复方汤剂进行萃取分离，得到不同提取部位，活性结果显示多糖部位能够延长秀丽线虫寿命。针对复方汤剂及其萃取部位开展的鉴定和分析发现，石油醚部位含有二苯乙烯苷、乙酸乙酯部位含有旱莲苷A和芦丁、正丁醇部位含有黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷，多糖部位的总糖含量在50%以上。

许多研究表明，中药多糖对衰老及相关疾病具有重要作用。例如，我们曾经报道黄芪多糖能够抑制亨廷顿舞蹈病秀丽线虫模型体内多聚谷氨酰胺(PolyQ)的聚集并能有效缓解PolyQ聚集产生的神经毒性，同时还能延长秀丽线虫的寿命[4]。在6-羟多巴胺引起的神经毒性秀丽线虫模型中，黄芪多糖也能够缓解毒性并提高抗氧化酶活性[5]。此外，有报道显示，何首乌多糖和熟地黄多糖都有一定的抗氧化作用[9-10]。因此，在本文工作基础上，可以针对复方汤剂的多糖组分及其组合开展进一步的研究。